骨关节炎|牛膝有效成分（ABE）干预BMSCs路径治疗骨关节炎获得重大曾国华|一多三少|胃结石|广州

作者：马笃军课题组
广州中医药大学第四临床医学院
骨性关节炎（OA）是中老年人常见的慢性关节疾病，涉及关节软骨、滑膜、软骨下骨等关节组织，主要表现为关节疼痛、僵硬及活动受限。OA的病因尚未明确，年龄、性别、肥胖、遗传等是发病的高危因素。OA的治疗目前市场上还没有有效的手段。
马笃军课题组通过对既往治疗OA文献的数据挖掘和结合广东省名中医彭力平教授治疗膝骨病的临床经验总结，发现怀牛膝是治疗OA频率最高的药物，牛膝独特的“标本兼治”和“引经”作用，使我们设想，牛膝的“强筋”功效，应包括对关节软骨的防退变、促修复功能。牛膝的化学成分主要有多糖类、皂苷类、甾酮类、黄酮类及多种微量元素等，针对关节疾患的主要药理作用包括抗炎镇痛，还具有促进软骨细胞增殖、促进骨髓干细胞归巢、降低软骨细胞凋亡率（通过影响 PI3K/AKT 通路）等作用。基于前期研究，马笃军课题组通过系列的分子生物实验、组织工程实验、动物实验及临床实验反复的验证，获得了治疗OA的重大突破。
怀牛膝：性味辛、苦，平。入肝、肾、膀胱经。具有活血化瘀，利关节，引血下行，补肝肾的功效。
一、基于CRISPR/Cas9技术探讨牛膝有效成分促进BMSCs软骨分化的网络机制研究
以关节软骨损伤为核心病理改变的骨关节炎疾病，自然修复软骨组织缺乏正常力学性能，尚无理想药物和疗法修复软骨，成为治疗难点。骨髓间充质干细胞（BMSCs）能优于其他来源细胞分化为软骨细胞，中药干预下的干细胞软骨分化具有特色和优势，但促软骨分化的研究较少。前期研究发现，牛膝含药血清培养BMSCs能促使其明显表达软骨细胞标志性Sox9、蛋白聚糖、Ⅱ型胶原蛋白，表明BMSCs向软骨细胞分化，但作用机制不清楚。马笃军课题组通过兔BMSCs体外培养进行BMSCs和牛膝含药血清与经典软骨诱导剂对照培养，促使BMSCs体外诱导软骨形成。采用蛋白组学iTRAQ技术、基因组高通量测序筛选牛膝诱导软骨分化主要差异蛋白、基因及作用信号通路，用CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑特异靶点RAB39B基因验证结果，揭示牛膝对BMSCs体外扩增和软骨细胞定向分化的机理。证实牛膝善“补肝肾、强筋骨”的中医理论，为临床解决关节软骨损伤、退变的修复提供了理论依据（见图1-7）。
【 骨关节炎|牛膝有效成分（ABE）干预BMSCs路径治疗骨关节炎获得重大】
文章插图
图1 CRISPR/Cas9 的结构和作用机制图

文章插图
图2骨髓间充质干细胞培养及鉴定结果

文章插图
图3 LentiCRISPRv2GFP 载体信息图谱
图4 RAB39B 敲除慢病毒感染兔骨髓间充质干细胞 (×100)
图5 qRT-PCR 检测 CRISPR/Cas9 系统基因敲除 RAB39B 后骨髓间充质干细胞中 COLⅡ、COLⅩmRNA 表达

文章插图
图6 Western blot 检测 CRISPR/Cas9 系统基因敲除 RAB39B后骨髓间充质干细胞软骨分化相关通路 RHOA、 LIMK、 Sox9 蛋白表达变化

文章插图
图7 基因编辑治疗骨关节炎的路径假想图
二、牛膝有效成分干预BMSC-Exos对 OA模型兔局部骨组织超微结构及炎症小体的影响
观察牛膝醇提物含药血清培养的骨髓间充质干细胞来源外泌体（BMSC-Exos）对实验兔骨关节炎模型关节局部骨组织超微结构及炎症小体的影响。