模型|《细胞》：CAR-T“变身”，意在躺平！( 二 ) 通路|信号|基因|RNAseq|实体|肿瘤

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▲ CD8+ CAR-T被特异性抗原刺激了26天之后（before rest），在加了IL-15的培养液中休息一天（After rest+IL-15），裂解肿瘤的能力得到恢复
代表CAR-T功能异常的模型构建好了，那跟以往的耗竭模型相比，有什么异同呢？
首先来做个bulk RNAseq ，比对一下没受过刺激的（Day 0）细胞和刺激后第28天的CD8+ CAR-T细胞吧。获得这个异常模型的转录变化特征之后，把它和两个耗竭模型外加四组病人中失效的CD8+ TIL RNAseq数据进行比较，得出它们之间有一部分上调的基因显著重叠，其中就包括T细胞耗竭的相关基因[3 ， 4] 。
向老模型确认过眼神之后，下面再来说说这个研究中的新发现。研究人员用通路分析软件IPA来进一步分析RNAseq数据，探索表达失调的基因所在信号通路的生物学意义。
除了众所周知的T细胞耗竭信号PD-1/PD-L1和CTLA4之外，与NK细胞有关的一些通路也出现在了持续抗原刺激CD8+ CAR-T的上调基因清单中，包括一众NK受体：KLRC1、KLRC2、KLRC3、KLRB1、KLRD1和KIR2DL4 。
单细胞RNAseq也提供了重要的证据支持。和没受过刺激（Day 0）相比，经过慢性刺激了20天的CAR-T中显示出两个组群（Cluster1/4），和bulk RNAseq中上调的基因显著重合，都包括NK相关基因。在这两个代表异常CAR-T的组群中，选出表达变化最大的30个基因，暂定为异常CAR-T的特征基因。这样就从整体以及单细胞的转录层面，找出了CAR-T异常的一组共性特征。

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▲ 在刺激了20天的CAR-T细胞中，异常特征基因的表达上升。
点图中的每列代表单细胞测序中发现的一个组群
小鼠模型中是这样，那么在病人中如何呢？
在弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）的临床试验中， CAR-T在大部分病人体内是能正常扩增的，除了3/17的病人在回输CAR-T的10天内出现了大量这种像NK的CAR-T细胞。其中，NK状CAR-T细胞最多的病人甚至对CAR-T治疗没有反应。总之，以上体内实验和病人数据，实锤了NK状CAR-T和功能失调的相关性。

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在蛋白层面，CD8+CAR-T细胞中， NK受体确实随持续抗原刺激时间变化而上升了，而且并不属于NKT细胞。质谱流式细胞数据表示，有一小撮没受过刺激（Day 0）的T细胞随着慢性刺激，逐渐演变成像NK的 T细胞。
那么问题来了：这个像NK的T细胞是本来就有，在持续抗原刺激中以压倒性优势增长胜出的呢，还是由其他细胞转化而来的呢？
为了回答这个问题，他们首先确定了NK状T细胞的特征标记：有两组共表达T细胞和NK细胞特征的标记， CD3+CD56+或者CD3+KLRB1+ 。敲除CD56+基本相当于去掉了NK细胞和NK状T细胞。
接下来为了验证细胞的来源，从没受过刺激（Day 0）的CAR-T细胞中敲除CD56+ ，然后重复持续抗原刺激实验，结果和没删除CD56+的实验并没有什么不同。从源头上删了所有跟NK相关的细胞，刺激之后还能再有，那就只能是从T细胞转换过来的了。

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▲ 左图是敲除CD56前后，初始的（Day0）CAR-T中NK状T细胞（CD3+CD56+）的出现频率。
右图是无论初始状态有无CD56 ，慢性抗原刺激之下，都会产生同等数量的NK状T细胞。