小鼠心肌纤维化影响肥厚型心肌病方案设计分享——Apelin-13/Sphk1/S1P/Rho _健康小知识

肥厚型心肌病（HCM）是一种常染色体线性遗传性性疾病，目前已证实，至少14个基因突变与肥厚型心肌病的发病有关，其中有10种是编码肌小节结构蛋白的基因，绝大部分突变位于这些基因。其特征为非对称性心肌肥厚，心肌细胞排列紊乱，间质纤维化，心脏舒张功能受损，是年轻人心脏性猝死的首位病因和心力衰竭的主要原因之一。
近年来大量研究表明，心肌纤维化可出现在高血压、心肌梗死及心力衰竭等多种心血管疾病中，是心肌重构的主要表现之一。心肌纤维化是HCM典型的组织学改变，即有胶原纤维在细胞外沉积增加的间质纤维化，也包括了心肌坏死后瘢痕组织替代原有的细胞。研究还发现， Apelin-13在抑制环磷酸腺苷生成和促进细胞的趋化作用方面表现出更强的生物活性，在高血压、冠心病及肺动脉高压动物模型中均证实可以对抗心肌纤维化的发生，因此推测Apelin可能影响心肌纤维化的发生。
多种文献研究已证实HCM中心肌纤维化扩展一定程度上与转化生长因子β(TGF-β)激活成纤维细胞，促进胶原分子表达有关。在肺、皮肤及心肌成纤维细胞， TGF-β可以激活SphK1 ，进而使S1P表达及活性增加。 Rho和成纤维细胞的分化也有关联， SphK1可以激活S1P ，与受体S1PR2结合后，激活Rho ，进而促进心肌成纤维细胞到肌纤维细胞的转化，促进胶原纤维的形成。在主动脉缩窄致心衰模型的研究显示， Apelin通过Sphk1/S1P通路抑制TGF-β介导的心肌成纤维细胞的分化，降低心室重构。因此综上推测可能的再HCM中Apelin通过调控Sphk1/S1P/Rho从而在肌纤维化中发挥作用。
一、小鼠心肌纤维化细胞模型建立
方法1
（1）小鼠心肌细胞系H9c2
（2）cTnIR145G转基因小鼠心肌细胞系H9c2
WB检测cTnIR145G、CollIα1、TGFβ、β-肌球蛋白重链，证明心肌纤维化的模型简历成功；
方法2
（1）原代小鼠心肌细胞
（2）原代小鼠心肌细胞+AngⅡ10nmol/L,诱导48h;
（3）原代小鼠心肌细胞+AngⅡ100nmol/L,诱导48h;
（4）原代小鼠心肌细胞+AngⅡ1mmol/L,诱导48h;
WB检测CollIα1、TGFβ、β-肌球蛋白重链，证明心肌纤维化的模型建立成功；
二、Apelin-13是否降低小鼠心肌细胞的纤维化反应
（1）cTnIR145G转化的心肌细胞H9C2
（2）cTnIR145G转化的心肌细胞H9C2+Apelin-13 ， 1nm+48h
（3）cTnIR145G转化的心肌细胞H9C2+Apelin-13 ， 10nm+48h
（4）cTnIR145G转化的心肌细胞H9C2+Apelin-13 ， 100nm+48h
（5）原代小鼠心肌细胞
（6）原代小鼠心肌细胞+AngⅡ100nmol/L,诱导48h;
（7）原代小鼠心肌细胞+AngⅡ100nmol/L+Apelin-1310nmol/L,诱导48h
（8）原代小鼠心肌细胞+AngⅡ100nmol/L+Apelin-13100nmol/L,诱导48h
WB检测CollIα1和TGFβ ，确定最佳Apelin-13处理浓度。
三、Apelin-13处理心肌细胞是否影响下游信号基因SphK1/SIRT3/AMPK以及细胞凋亡
（1）cTnIR145G转化的心肌细胞H9C2
（2）cTnIR145G转化的心肌细胞H9C2+Apelin-13 ， 100nm+48h
（3）原代小鼠心肌细胞
（4）原代小鼠心肌细胞+AngⅡ100nmol/L+Apelin-13100nmol/L,诱导48h
检测
（1）QPCR检测：CollIα1和SphK1、SIRT3；
（2）WB检测：β-肌球蛋白重链、SphK1、SIRT3、Fox03a、p-Fox03a、AMPK、p-AMPK、Bax、Bcl-2；
（3）免疫荧光检测：β-肌球蛋白重链， αSMA；
（4）检测细胞内ROS含量和ATP含量；
（5）流式细胞仪检测细胞凋亡；
四、Apelin-13降低心肌细胞的纤维化反应是否通过SphK1/S1P/Rho途径
（1）cTnIR145G转化的心肌细胞
（2）cTnIR145G转化的心肌细胞+siRNA-S1P2