科研丨GUT(IF:31.7): 肠道菌群通过PUFA相关神经炎症调节阿尔茨海默病的病理和认知障碍( 五 )

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图4SCFAs触发GF3×Tg小鼠的C/EBPβ/AEP激活和认知缺陷以及被PGE2-G加剧的炎症。
(A)免疫印迹显示有/无SCFAs处理的GF小鼠大脑中p-C/EBPβ、C/EBPβ、AEP、APP和tau蛋白表达和加工，以及花生四烯酸代谢。 (B)有/无SCFAs处理的GF3×Tg小鼠脑裂解物中的AEP活性测定。 SCFAs处理可提高GF3×Tg小鼠大脑中的AEP活性。 (C)GF3×Tg小鼠和SPF3×Tg小鼠脑裂解物中的促炎细胞因子IL1-β、IL-6和TNFα浓度。 (D)使用人Aβ40和Aβ42ELISA试剂盒检测GF3×Tg小鼠皮层中Aβ40和Aβ42的浓度。与对照处理的GF3×Tg小鼠相比， SCFAs处理的GF3×Tg小鼠的大脑皮层中Aβ42的浓度显著增加。 (E)有/无SCFAs处理的GF3×Tg小鼠大脑海马CA1区Aβ(红色)和ThS(绿色)、AT8(绿色)和T22(红色)的免疫荧光染色。比例尺：20μm 。 (F)定量分析Aβ阳性细胞、ThS阳性细胞、AT8阳性细胞和T22阳性细胞。在SCFAs处理的GF3×Tg小鼠大脑中， Aβ、ThS、AT8和T22阳性细胞的密度显著增加。 (G ， H)Y迷宫行为测试。自发交替(G) ，进入臂次数(H) 。 (I)GF小鼠和SPF小鼠粪便中花生四烯酸及其代谢物的浓度。 (J)GF3×Tg小鼠、PGE2-G或SCFAs处理GF3×Tg小鼠、以及SCFAs和PGE2-G处理GF3×Tg小鼠皮层中Iba-1染色小胶质细胞(红色)的代表性图像(上图)和3D重建(下图) 。 (K ， L)定量分析驻留在皮层中小胶质细胞的直径和分支点数量。 Aβ ，淀粉样蛋白-β；AEP ，天冬酰胺内肽酶；GF ，无菌；PGE2-G ，前列腺素E2-1-甘油酯；SCFA ，短链脂肪酸。
5与PUFA代谢有关的拟杆菌菌株在AD微生物再定植的GF小鼠中升高
由于AD患者表现出微生物组改变，我们试图确定人源性肠道微生物组在转移到GF小鼠时是否会影响疾病结果。我们将三个AD患者和三个HC供体的粪便样本接种到GF小鼠中。收集人源化小鼠粪便颗粒，提取细菌DNA ，并进行16SrRNA测序。微生物组分析显示，在ex-GF小鼠中，通过粪便微生物群移植(FMT)建立了人类肠道微生物群。在门水平上，分类学分析表明FMT受体小鼠的微生物群落与人类供体接种物的微生物门非常相似(图5A) 。如之前的几项研究所示，受体小鼠成功携带了在供体接种物中检测到的100%门水平和86%属水平的分类群。此外， β多样性分析PCoA显示， FMT受体小鼠的微生物群与其人类供体对应物聚集在一起(图5B) 。重要的是，我们的研究证实，供体和FMT受体小鼠之间的α多样性没有显著变化。因此，我们的数据表明人类肠道微生物群在GF小鼠中成功植入。此外，我们的研究结果表明， Bacteroidesintestinalis(图5C)、Bacteroidesfragilis(图5D)和Bacteroidesxylanivsolvens(图5E)的平均相对丰度显著增加，而Parabacteroidesgoldsteiniii(图5F)、Bacteroidesovatus(图5G)和Clostridiumbolteae的平均相对丰度显著降低(图5H) 。值得注意的是，在AD人源化ex-GF小鼠中，三种细菌菌株(B.nestiinalis、B.fragilis和B.xylanivsolvens)培养液中AA及其代谢物浓度的定量分析表明，这些细菌参与AA代谢并可产生AA代谢物(图5I) 。

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图5对人源化GF3×Tg小鼠粪便进行微生物组分析，发现AD患者粪便菌群接种GF小鼠后，粪便中的拟杆菌增多。
(A)通过高通量测序分析确定细菌门的相对丰度。 (B)微生物群落结构的主坐标图(PcoA) 。 (C-H)细菌种类的平均频率。 (I)Bacteroidesintestinalis、Bacteroidesfragilis和Bacteroidesxylanisolvens体外培养物中花生四烯酸(AA)及其代谢物的浓度。 AD ，阿尔茨海默病；ANOVA ，方差分析。
6AD患者肠道菌群可增强AD病理并促进认知缺陷
为了评估人类AD粪便样本是否会加速GF小鼠的AD病理，我们进行了IF染色，发现与HC相比， AD人源化ex-GF3×Tg小鼠大脑中ThS阳性Aβ沉积加重。此外，海马中的AT8/T22也表现出类似的模式(图6A ， B) ，支持AD患者微生物组促进GF3×Tg小鼠的AD病理，包括老年斑和NFT 。定量结果显示，在接种AD粪便的GF小鼠中， Aβ42(而非Aβ40)浓度显著增加(图6C) 。 IF染色显示，与HC相比， ex-GF小鼠AD粪便接种后C/EBPβ和AEP明显升高；因此， TauN368、APPC586和Aβ均显著增强，并伴有明显的小胶质细胞激活。与AA代谢酶、LKB4和12-HHT受体、BLT1和BLT2的上调一致， C/EBPβ的两个下游转录靶标在人类AD微生物移植的ex-GF小鼠中也明显升高。与AD突出的病理特征一致，免疫印迹显示，与HC相比， AD粪便移植的ex-GF小鼠中包括PSD95、GluR2和Spinophilin在内的突触蛋白降低。与这些结果一致的是， AD粪便人源化小鼠的BDNF水平显著降低。同时，海马神经元中的树突棘大大减少。因此，与HC小鼠相比， AD粪便人源化小鼠在Y迷宫中表现出认知缺陷，尽管进入臂的总数没有统计学变化。然而，一对接种了AD和HC粪便样本的ex-GF小鼠表现出明显减少的臂进入(图6D-G) 。正如预期的那样， Iba-1染色和3D小胶质细胞重建分析表明AD患者菌群接种GF小鼠的小胶质细胞高度活化且形态成熟(图6H-K) 。因此，这些数据支持AD和HC患者之间的粪便微生物群落差异在接种到GF小鼠后可能仍然存在。