科研丨GUT(IF:31.7): 肠道菌群通过PUFA相关神经炎症调节阿尔茨海默病的病理和认知障碍( 二 )

尽管两组小鼠大脑中BDNF水平相似，但高尔基染色显示，与SPF小鼠相比， GF小鼠海马神经元中的树突棘显著升高。同时，在Y迷宫中的行为表明， GF小鼠的空间记忆功能明显优于SPF小鼠(图1D ， E) 。小胶质细胞的成熟和激活与AD大脑的慢性神经炎症有关。在GF小鼠的皮层小胶质细胞中， Iba-1染色显示出直径、分支和节点数量增加。小胶质细胞的半自动定量形态测量三维测量显示，与SPF小鼠相比， GF小鼠的这些小胶质细胞形态发生了显著变化(图1F-I) 。因此，肠道微生物群促进AD病理、认知缺陷和小胶质细胞激活。

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图1与SPF3×Tg小鼠相比， GF3×Tg小鼠表现出更少的AD病理和更好的认知功能。
(A)GF3×Tg小鼠和SPF小鼠大脑额叶皮层区的Aβ(红色)和ThS(绿色) ，海马CA1区的AT8(绿色)和T22(红色)的免疫荧光染色。比例尺：20μm 。 (B)定量分析显示SPF小鼠脑中Aβ、ThS、AT8和T22阳性细胞的密度显著增加。 (C)使用人Aβ40和Aβ42ELISA试剂盒检测GF3×Tg小鼠和SPF3×Tg小鼠皮层中Aβ40和Aβ42的浓度。 SPF3×Tg小鼠皮层中Aβ42含量明显高于GF3×Tg小鼠。 (D、E)Y迷宫行为测试。自发交替(%)(D) ，进入臂次数(E) 。 (F)GF3×Tg小鼠和SPF3×Tg小鼠皮层中Iba-1(红色)免疫荧光染色的代表性图像(上图)和Iba-1染色小胶质细胞的3D重建(下图) 。 (G-I)定量分析位于皮层中的小胶质细胞的直径、分支点数和总分支长度。 Aβ ，淀粉样蛋白-β；GF ，无菌；SPF ，无特定病原体。
2肠道微生物激活C/EBPβ/AEP途径，升高与PUFA代谢有关的促炎酶
我们最近的研究支持C/EBPβ/AEP信号通路在时空上调控AD病理。为了评估是否需要完整的肠道微生物组来刺激这一途径，从而促进AD的发病，我们进行了免疫印迹分析，发现与SFP小鼠相比， GF3×Tg小鼠大脑中的C/EBPβ/AEP信号减弱。随后， AEP截短的tauN368和APPN585片段减少，与p-tauAT8和AT100活性降低相关。值得注意的是，与SPF小鼠相比， GF3×Tg小鼠的Lox5 ， Cox1和Cox2水平明显降低(图2A ， B) ，这与先前的研究结果相吻合，即AA代谢途径不仅是炎症的核心网络，也是工作记忆障碍导致AD发病的主要原因。正如预期的那样，蛋白酶检测显示GF小鼠的AEP酶活性低于SPF小鼠，与活性AEP水平降低一致(图2C) 。由于C/EBPβ是IL-6的主要转录因子，因此，与SPF小鼠相比， GF小鼠中的IL-6浓度显著降低(图2D) 。 qRT-PCR结果显示，与SPF小鼠相比， GF小鼠的CEBPβ靶标/AA通路基因略有降低(图2E) ，与RNAseq数据相对应。然而， qRT-PCR数据没有统计学意义，这可能是由于定量PCR(qPCR)分析的差异较大所致。
脑切片IF共染色显示， GF小鼠与SPF小鼠相比海马和皮层中C/EBPβ上调、AEP激活、Aβ积累、TauN368片段化和p-Tau(AT8)减少(图4A-D) ，与GF小鼠中C/EBPβ/AEP信号减弱以及APPN585和TauN368片段减弱一致。此外， GF小鼠大脑中5-Lox ， Cox1和Cox2的IF活性明显降低，与C/EBPβ信号减弱密切相关。因此，与SPF小鼠相比， GF小鼠的C/EBPβ/AEP信号和AA相关炎症酶减少，这表明肠道微生物群通过激活C/EBPβ/AEP途径调节这些效应因子的表达。这些结果与先前的报道一致，即C/EBPβ作为这些AA相关炎症酶的转录因子发挥作用。免疫组化(IHC)染色进一步证实，与SPF小鼠相比， GF小鼠大脑中的Iba-1和AEP均降低，与皮层中Iba1和AEPIF共染色一致。因此， GF3×Tg小鼠表现出C/EBPβ/AEP通路减弱和AA相关炎症减弱。

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图2GF3×Tg小鼠C/EBPβ/AEP通路减弱和AA相关炎症减弱。
(A)免疫印迹显示GF3×Tg小鼠和SPF3×Tg小鼠大脑中的p-C/EBPβ、C/EBPβ、AEP、APP和tau蛋白表达、加工以及花生四烯酸代谢。 (B)免疫印迹定量分析。用imageJ统计活性AEP、TauN368、APPN585、C/EBPβ、LOX5、Cox1、COX2、BLT1和BLT2的条带，并用β-肌动蛋白归一化。 (C)GF3×Tg小鼠和SPF3×Tg小鼠脑裂解物中AEP活性测定。与GF3×Tg小鼠相比， SPF3×Tg小鼠的AEP活性升高。 (D)GF3×Tg小鼠和SPF3×Tg小鼠脑裂解物中促炎细胞因子IL1-β、IL-6和TNFα的浓度。 (E)对GF小鼠与SPF小鼠的脑样本进行定量RT-PCR分析，比较C/EBPb靶向AA通路基因。 AA ，花生四烯酸；AEP ，天冬酰胺内肽酶；COX ，环氧酶；SPF ，无特定病原体。