PDX模型联合CRISPR/Cas9筛选儿童急淋化疗耐药治疗靶点 _健康小知识

撰文|吴培煌责编|周叶斌
获得性耐药是一个目前尚未解决的临床挑战，也是癌症患者获得治愈的主要障碍。尽管化疗在临床上治疗肿瘤已几十年，但其获得性耐药的确切机制仍不充分，阻碍了有效的干预。人们做了大量的工作来确定获得性耐药性的机制，包括对临床样本测序确定耐药相关突变和表达谱，单细胞测序揭示肿瘤的异质性和克隆进化，但由于技术上困难，迄今为止，获得性耐联合化疗的体内研究较少。
PDX模型是一种将肿瘤患者的肿瘤组织移植至免疫缺陷型小鼠体内，并使肿瘤组织在小鼠体内生长而构建成的一种肿瘤模型，已经被用于研究多种药物和实体肿瘤耐药性，被认为是目前可用的与患者最相关的临床前模型系统。
2022年12月，由来自德国和奥地利的多单位联合研究团队，在Leukemia上发表了题为InvivoPDXCRISPR/Cas9screensrevealmutualtherapeutictargetstoovercomeheterogeneousacquiredchemo-resistance的文章。为了寻找研究和克服获得性化疗耐药，最大程度模拟临床情况，该研究团队成功建立一个类似于临床过程的获得性耐药模型用于深入研究耐药机制。他们选用来源于急性淋巴白血病患儿患者肿瘤细胞的异种移植(PDX)模型，整合表型和体内药物反应预测患者的临床病程，并对模型进行长期体内联合化疗并结合复杂的基因编辑技术筛选耐药基因。同时，研究团队通过对耐药模型的基因组测序，发现长期化疗诱导了肿瘤细胞广泛的基因组改变，而进一步体内功能基因组筛选发现BCL2、BRIP1和COPS2等治疗靶点，即便相同来源的耐药株存在异质性，但因存在共同表达谱特征可通过抑制单一靶点克服耐药性。
研究团队首先成功建立一个模拟临床治疗过程的ALL-PDX获得性耐药体内模型。研究者首先从急性淋巴细胞白血病患儿体内获取白血病细胞，进行荧光素酶示踪标记，并将标记好的白血病细胞植入小鼠体内，为模拟临床获得性耐药的过程，他们采用目前临床上广泛使用的细胞毒性药物（化疗药物）连续18周作用于ALL-PDX模型小鼠，活体成像来动态观测小鼠模型体内患者肿瘤细胞生长状况及其对药物的治疗反应，并在此基础上设计和筛选出多药联合耐药的治疗靶点。利用体内CRISPR-Cas9筛选技术敲除基因及通过靶点的抑制剂来验证。

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研究总体流程图：上.从急性淋巴细胞白血病患儿体内取得肿瘤细胞，植入NGS小鼠体内构建PDX模型，并模拟临床的多化疗药物联合方案给小鼠模型进行长达4个月的用药，期间监测肿瘤生长情况，最终获得耐药株；中.对构建的耐药株进行基因组测序，尽管来源同个患者的耐药株存在异质性，但有共同的基因表达谱；下.采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除耐药株共同表达的基因进行功能基因筛选并对靶点进行验证
研究团队采用环磷酰胺(Cyclo)和长春新碱(VCR)的两药组合方案对PDX小鼠模型进行长达18周的治疗(下图A) ，小鼠肿瘤负荷能有效降低两个数量级以上并呈现良好的耐受性。模型动物在肿瘤高负荷下开始治疗，单药对肿瘤进展的影响很小，但在治疗开始后的4周内，联合用药使肿瘤负荷降低了两个数量级，表明细胞最初对治疗很敏感(下图C) 。此后，肿瘤在治疗下持续数周治疗下无增殖现象，类似于最小残留病变(MRD)阶段和耐药状态（称为Persist）。最终，耐药细胞都恢复了生长(下图B,C) 。 8只小鼠重复模型均表现出相似的获得耐药动力学，表明模型的一致性较好，因肿瘤均来自同一患者标注为D1-D8 。