基于CRISPR技术的通用型儿童白血病CAR-T早期临床试验结果公布 _健康小知识

撰文|周叶斌
尽管标危儿童急性B细胞白血病生存率在90%以上，但高危复发型的预后较差，亟需治疗方法上的创新。靶向CD19的自体CAR-T治疗已获批用于复发或难治急性B细胞白血病（B-ALL），但这种对患者本人T淋巴细胞做基因工程改造的治疗方法在生产与物流上都非常有挑战性，加之高昂的生产成本，推广起来并不容易。
通过基因工程改造，生产出适用于任何患者的通用型CAR-T ，可以降低生产成本，惠及更多患者。当下CAR-T治疗的一大挑战是采用自体细胞，意味着患者必须等待生产完成方能用上药物，对于晚期癌症患者来说，等待意味冒着疾病进展的风险，而通用型CAR-T可以避免这个问题。此外，用健康人T细胞生产出来的通用型CAR-T ，可能也会比癌症患者（特别是经历多线化疗治疗的患者）T细胞制备的CAR-T有更好的功能。
2022年10月26日，来自英国的研究人员在ScienceTranslationalMedicine上发表了题为Phase1clinicaltrialofCRISPR-engineeredCAR19universalTcellsfortreatmentofchildrenwithrefractoryBcellleukemia的论文，报告了采用CRISPR技术做基因编辑，生产出来的通用型CD19CAR-T（TT52CAR19T）在儿童复发型B-ALL的一期临床试验结果。研究获得了这类通用型CAR-T的初步安全性数据，为今后探索CRISPR基因编辑的细胞疗法提供了重要证据。
该论文中的通用型CAR-T设计思路与同一研究组过往用TALEN技术（另一种基因编辑方法）生产的通用型CAR-T一致。研究人员敲除T细胞受体（TCR）的alpha链（TRAC）获得通用型T细胞，此外CD52也被敲除。针对CD52的单克隆抗体alemtuzumab会用于CAR-T细胞治疗准备期的淋巴细胞清除，敲除CD52意味着这种通用型CAR-T在淋巴细胞清除过程中不会受影响，相比患者体内的T细胞获得了生存优势。
研究人员开发这种通用CAR-T（TT52CAR19T）的应用场景设想是一种过渡型治疗：清除患者自体淋巴细胞后的1-4周时间内，利用一次TT52CAR19T输入带来的抗肿瘤作用迅速杀死癌细胞，之后再进行干细胞移植，恢复患者的免疫系统。这种过渡式治疗既发挥了TT52CAR19T的抗肿瘤作用，在之后的干细胞移植过程中经过基因编辑的CAR-T细胞又会被清除，避免了基因编辑中万一有脱靶效应的潜在安全性问题。
该研究中作者利用慢病毒载体（lentiviralvector）来构造具有基因编辑功能的CAR19 ，用于CAR-T生产。在载体的3端带有在Cas9作用下可编辑TRAC（TCR的alpha链）和CD52靶点的sgRNA序列。在生产过程中，健康志愿者的外周血淋巴细胞被激活，然后用电穿孔引入Cas9的mRNA 。之后这些细胞经过扩增，完成基因编辑，再用磁珠除去残余的TCR阳性细胞，即获得了通用型CAR-T 。

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CAR-T载体结构与生产流程示意图
来自三位志愿者的通用型CAR-T细胞产品在生产后通过冷冻保存。每位志愿者的细胞产品都足够用于几十位患者的治疗。分析显示经过磁珠与过柱处理，产品中具有高CAR19表达（86%~98%）， TCR阳性仅为0.1%~1.1% 。研究人员用TIDE和二代测序分析靶点编辑效果与脱靶效应，结果显示平均每个细胞整合了2.94~4.57个病毒载体拷贝，而预测的潜在脱靶位点未发现明显的编辑痕迹。体外细胞实验也证实了TT52CAR19T具有良好的CD19+肿瘤细胞杀伤能力。

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生产的CAR-T各项指标
接下来在开放标签的一期临床试验（NCT04557436）里，研究人员探索了TT52CAR19T在6个月到18岁难治或复发B-ALL患者中的安全性与有效性。符合标准的患者入组后，接受完根据个体制订的缩小肿瘤治疗后，会经历标准的淋巴细胞清除过程（包括CD52抗体alemtuzumab），此后会接受1个剂量的TT52CAR19T治疗（每千克体重80-200万细胞）。 TT52CAR19T治疗后患儿会在医院观察28天，若在第28天处于缓解状态，则会进入干细胞移植流程。在移植准备过程中残余的TT52CAR19T会被清除掉。