【康日百奥业务181-1849-0181】理化属性表征 _健康小知识

理化属性表征
01抗体药物结构
抗体药物结构表征主要包括以下参数：
1)完整分子量
2)轻链分子量
3)重链分子量
4)氨基酸序列
5)二硫键
6)自由巯基
7)糖基化位点
8)N-端测序
9)翻译后修饰
10)二、三级结构表征
在前9项一级结构表征中， LC/MS是最主要和最基础的表征方法，二三级结构涉及使用圆二色谱，红外光谱等，细节不作赘述。
抗体结构表征的目的，除了全面表征抗体药物质量，另外一个核心目标是寻找可能影响抗体药物疗效的关键氨基酸残基、关键氨基酸的翻译后修饰，进行相关工艺改造和确认，避免在工艺开发后期以及临床阶段，产生不良影响，也是本文主要的讨论内容，主要包括：脱酰胺，异构化， Met和Trp氧化，未配对的半胱氨酸等。

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1.1脱酰胺
天冬酰胺（Asn），尤其是CDR区的Asn残基脱酰胺，是单克隆抗体药物最常遇到的降解途径之一。当Asn后面是小的且活跃的甘氨酸（Gly）残基（NG基序）时，容易发生脱酰胺，并且如果发生在CDR区，会导致对抗原结合亲和力降低，抗体效力丧失。因而在抗体测序和生物信息学评估时，需要关注CDR区的Asn-Gly残基，并在强制降解阶段对其进行评估。
此外在IgG的Fc段“PENNY”环肽中，也包含脱酰胺易感位点，但是因为通常不会对抗体药物结合抗原带来负面影响，一般不做重点关注。
1.2氨基酸氧化
蛋氨酸（Met）和色氨酸（Trp）残基容易发生氧化。其中重链CDR2中的蛋氨酸以及Fc区中的蛋氨酸氧化并不会影响抗原结合。但是当氧化水平较高，或者发生在抗原结合的关键CDR区域，会降低抗原结合能力，降低抗体药物的有效性。
靠近CH2-CH3区域的蛋氨酸残基易发生氧化，导致热稳定性下降，聚集增加，补体依赖性细胞毒性（CDC）下降，与FcRn的结合亲和力下降以及体内半衰期缩短。
CDR中Trp残基的氧化，可能导致有效性降低，热稳定性降低和聚集倾向增加。
总体而言，生物信息学分析和一级序列测定时，应重点关注CDR区Met和Trp的氧化，并确定它们的敏感性，必要时在工艺阶段采取适度控制策略。

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1.3Asp异构化
Asp异构化是单克隆抗体药物的另一种降解途径。 CDR区的Asp残基，如果后面是Gly残基， His或Ser时，通常易于异构化。 CDR区发生异构化，可能导致抗原结合亲和力降低。当pH值在5左右时，有利于Asp异构化，因此抗体药物的制剂配方开发时，需要注意其pH值尽可能避开5 。
1.4糖基化位点
IgGCH2Asn-297连接的N糖为核心7糖结构，四个N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和三个甘露糖(Mannose)残基。根据抗体的功能需要，会对抗体的糖型进行改造，以获取相应的功能特性，以及延长或缩短抗体半衰期等。因而糖基位点检测分析贯穿于抗体药物工艺的整个过程，也是质量放行的关键质量属性。

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▲Biologicals(2017)
抗体糖工程改造主要有岩藻糖基化，乙酰葡糖胺化，半乳糖基化，唾液酸化四种。
通过核心岩藻糖基转移酶(Fut8)催化N-聚糖GlcNAc核心岩藻糖基化；通过乙酰葡糖胺基转移酶3(GNT3)在分支角Mannose上添加乙酰葡糖胺（GlcNAc）；通过β-1,4-半乳糖转移酶1(b4GALT1)在七糖末端的两个GlcNAc添加半乳糖，使其半乳糖化。这三种策略是改变和1型FcγR的结合。在核心岩藻糖基化以及半乳糖基化的基础上，在α2,6-唾液酸转移酶（ST6GAL1) ，可以增加抗体的唾液酸化，唾液酸化则可以增加和2型FcγR的结合。