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▲ PDX实验发现cirCDYL2与HER2阳性乳腺癌细胞产生曲妥珠单抗耐药有关
那到底cirCDYL2是怎么发挥作用的？为了找到这个问题的答案 ， 研究者不得不抽丝剥茧 ， 一步一步接近真相 。
首先他们发现 HER2与cirCDYL2之间没有直接的调控关系 ， 其中一个分子的表达量变化 ， 不会直接影响另一个分子 。 因此 ， 他们推测cirCDYL2应该跟HER2相关的信号通路蛋白有相互作用 。
通过蛋白质体外结合实验、环状RNA下拉实验、免疫沉淀等实验结果 ， 他们终于确定cirCDYL2与GRB7信号蛋白存在相互作用 。cirCDYL2是通过GRB7蛋白去促进HER2+乳腺癌细胞的曲妥珠单抗耐药 。
再进一步分析这两个分子之间的相互作用 ， 他们发现cirCDYL2使GRB7蛋白变得稳定 ， 但敲除cirCDYL2对GRB7的mRNA表达水平又没有显著影响 。 因此研究者们判断 cirCDYL2对GRB7的作用是发生在转录翻译之后 。
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▲ cirCDYL2使GRB7蛋白变得稳定
之前的研究已经发现 ， GRB7可以通过泛素化完成降解[6] ， 因此研究人员猜想cirCDYL2能影响GRB7的泛素化水平 。
随后他们发现 ， 将细胞内的Pin1蛋白基因 （GRB7的稳定性的调控蛋白）敲除 ， 可以增加GRB7蛋白的稳定性 ， 转染Pin1会提升GRB7蛋白泛素化水平 。 免疫沉淀实验发现 ， 过表达cirCDYL2可以在过表达Pin1的细胞环境下 ， 提升GRB7蛋白稳定性 ， 相比仅过表达Pin1的细胞 ， 同时过表达cirCDYL2和Pin1的细胞有更多GRB7蛋白可以被沉淀下来 。
所以 ，cirCDYL2是通过干预Pin1蛋白来抑制GRB7的泛素化降解 ， 导致GRB7的表达量上调 。
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▲ Pin1加剧GRB7蛋白降解 ， CirCDYL2抑制Pin1维持GRB7蛋白稳定
不过 ， 也有研究表明 ， GRB7只是一个衔接蛋白 ， 是通过与FAK蛋白结合来维持AKT和ERK信号蛋白的磷酸化激活状态 ， 进而促进HER2下游信号传导[7] 。
研究者们利用RNA结合蛋白免疫沉淀等实验发现 ， FAK蛋白与circCDYL2存在相互作用 。 而且相比对照组 ， 过表达cirCDYL2的细胞中 ， 能够发现更多FAK与GRB7蛋白结合的现象 ， 即 circCDYL2可促进GRB7与FAK结合 。
而将FAK沉默后 ， 对曲妥珠单抗耐药的细胞中P-AKT和P-ERK变少了 ， 这意味着耐药性减弱 。
这说明 cirCDYL2是通过FAK来促进HER2阳性乳腺癌细胞曲妥珠单抗耐药 。
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▲ circCDYL2-GRB7-FAK结合机制
最后 ， 研究者要在体内证明HER2阳性乳腺癌对曲妥珠单抗耐药确实与cirCDYL2-GRB7-FAK的作用机制有关 。
他们将SK-BR-3细胞改造成过表达cirCDYL2的P-SK-BR-3细胞和敲除cirCDYL2的SK-BR-3-R细胞 ， 并原位注射到小鼠乳房脂肪垫 ， 实验组小鼠一周注射两次曲妥珠单抗 ， 44天后将肿瘤取出观察结果 。
结果发现 ， 仅敲除cirCDYL2或者注射曲妥珠单抗这两种手段对已经耐药的肿瘤生长无明显影响 ， 但在敲除cirCDYL2且注射曲妥珠单抗的实验组 ， 肿瘤生长被显著抑制 。 这说明 敲除cirCDYL2可以逆转肿瘤对曲妥珠单抗的耐药 。
更有趣的是 ， 使用FAK或者GRB7蛋白抑制剂干预 ， 也可以达到敲除cirCDYL2类似的效果 。 即使是过表达cirCDYL2的肿瘤 ， 使用FAK或者GRB7蛋白抑制剂也可以缓解曲妥珠单抗耐药 。
因此 ，cirCDYL2确实促进了曲妥珠单抗耐药 ， FAK及GRB7蛋白抑制剂可缓解曲妥珠单抗耐药 。
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