经验分享：悬浮细胞中生产 AAV 载体细胞培养工艺开发简介( 三 ) _健康小知识

当VCD增加至1×106/mL时，病毒基因组滴度会有所提高。
DoE4
在下游纯化工艺中，完整衣壳的百分比和VG是有效分离完整衣壳的最重要因素。我们需要保证收获物中完整衣壳的百分比至少为10%才能进行rAAV2纯化。因此另外对rAAV2进行了一次实验设计(DoE)评估，这次研究了DNA浓度和收获时间(ToH)对生产过程中病毒基因组滴度和完整衣壳百分比的影响。
我们发现，尽管增加DNA浓度可以提高VG滴度，但会对完整衣壳的百分比产生不利影响（图8）。我们发现，为了获得高VG滴度但同时完整衣壳的百分比达到10%及以上， DNA浓度需为0.75μg/mL 。
在这些条件下，收获时间对VG滴度和完整衣壳的百分比没有显著影响。

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图8.DoE4中评估的参数表明，尽管增加DNA浓度会提高VG滴度(A) ，但完整衣壳的百分比(B)会受到不利影响。
通过总结rAAV2实验设计(DoE)1–4的结果，可以看出VG滴度和完整衣壳百分比随着时间的推移在逐步改善（图9）。但是没有达到我们关于完整衣壳百分比的标准，大家普遍认为AAV2进行完整衣壳优化有难度。因此，我们决定对已确定的AAV5（临床上另一个重要的血清型）的条件进行测试。

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图9.实验设计(DoE)研究发现VG滴度(A)和完整衣壳百分比(B)随时间推移而改善。
DoE5
我们证实了我们的AAV2转染方案可用于AAV5生产。 DNA浓度和转染孵育时间这两个参数十分重要。结果证实了DoE4中的发现：增加DNA浓度可提高VG滴度并降低完整衣壳百分比；转染时间对VG响应的影响很小（图10）。

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图10.(A).增加DNA浓度可以提高VG滴度。转染孵育时间对VG响应没有显著影响。 (B).增加DNA浓度会降低完整衣壳的百分比。使用低浓度DNA时，转染孵育时间对完整衣壳百分比的影响更大。
我们在实验设计(DoE)中进行了一项设计-空间优化模型测试，对获得10%或15%的完整衣壳百分比的概率进行评估。完整衣壳的百分比越高，用于选择转染参数的区域就越小（图11）。

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图11.我们用于研究达到(A)10%完整衣壳百分比和(B)15%完整衣壳百分比（绿色区域）概率的设计-空间优化模型。
在我们的实验设计(DoE)实验中，我们发现，高浓度的DNA可以提高VG滴度，并且转染孵育时间不会显著影响VG滴度。然而，通过查看完整衣壳百分比，我们却看到了相反的效果；通过降低DNA浓度和缩短孵育时间，可以提高完整衣壳的百分比。
总之， DoE5研究中对rAAV5生产的验证表明，缩短转染孵育时间对完整衣壳的百分比有积极影响。根据实验设计(DoE)实验中的响应结果，我们得出结论，在转染过程中， DNA浓度为0.75μg/mL ，孵育时间为15分钟，这可能是测试条件下的最佳状态。
优化的转染方案
最终的转染方案和参数如下表2所述：
表2.转染方案采用的最终参数

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为了确认转染孵育时间为15分钟的rAAV5生产转染方案，我们在ReadyToProcessWAVE?25生物反应器中进行了10L生产。使用生物反应器进行的收获满足了下游工艺中进一步纯化的所有验收标准。
结论和讨论
我们使用HyClone?培养基对HEK293T细胞进行了无血清悬浮生长驯化。通过直接移至新培养基中，可以在短时间内有效驯化细胞。细胞活力非常高，并且大多数细胞处于单细胞悬浮状态。细胞在HyCell?TransFx-H培养基中快速生长，群体倍增时间约为20小时。快速的细胞生长将缩短种子细胞培养放大和生产所需的时间。