金坚团队：首个靶向AKT变构位点的PROTAC( 三 ) _健康小知识

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图8.PROTAC62及阴性对照63和64的化学结构
首先，作者分别测试了PROTAC62、63、64及靶头化合物ARQ-092对AKT三种不同亚型（AKT1、AKT2、AKT3）的酶抑制活性（图9）。实验结果显示，相较于靶头化合物ARQ-092 ， PROTAC表现出减弱的抑制活性，但对于AKT1/2/3都具有抑制活性。

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图9.PROTAC62、63、64及ARQ-092的酶活测试
接下来，作者测试了PROTAC62、63、64在MS21（已报道的降解活性最好的靶向活性位点PROTAC）耐药且KRAS突变的结直肠癌细胞系SW620的降解活性（图10）。实验结果表明，化合物62能够呈现浓度依赖方式有效诱导SW620中的AKT降解，且DC50为23±16nM ，而阴性对照63和64无降解活性。

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图10.化合物62在sw620中的降解实验
随后，作者比较了62和MS21在其他几种携带KRAS或BRAF突变的癌细胞类型中的AKT降解效应（图11）。蛋白质印迹实验发现，化合物62可以有效诱导各种KRAS或BRAF突变的癌细胞中AKT的降解，而MS21表现出较差的AKT降解能力。

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图11.62和MS21在各种携带KRAS或BRAF突变的癌细胞蛋白降解实验
作者继续在SW620细胞系进行了蛋白降解机制研究（图12），实验结果表明化合物62可以以时间依赖的方式诱导AKT降解，并可以有效抑制磷酸化PRAS40蛋白水平。当加入NAE抑制剂MLN4924或蛋白酶体抑制剂MG132后，可以有效逆转AKT的降解效果。基于上述实验结果，作者认为化合物62诱导AKT蛋白的降解效果依赖于泛素蛋白酶体途径。

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图12.蛋白降解机制研究实验
为了探究PROTAC62蛋白质组范围内的降解选择性，作者对化合物62进行了基于全局串联质谱标签TMT定量蛋白分析的蛋白质组学研究，实验结果表明化合物62不能降解其他靶点蛋白，具有较好的靶点选择性（图13）。

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图13.化合物62的蛋白质组学研究
接下来，作者在SW620细胞系上测试了化合物62、靶头化合物ARQ-092、阴性对照64及降解剂MS21的抗增殖活性（图14）。从细胞集落形成实验可以看出，化合物62对SW620抑制活性与ARQ-092相当，而阴性对照化合物64和MS21表现出较弱抑制活性。
图14.化合物62、64、ARQ-092、MS21的细胞集落形成实验
最后，作者对化合物62进行了PK研究（图14），评估化合物62在小鼠体内的生物利用度。实验结果发现在给药后0.5h可达到最大血药浓度（Cmax=1μM），血药浓度保持在100nM以上至少可维持12小时。这些结果表明，化合物62表现出较好的PK性质，在体内可以获得足够的血浆暴露。

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图14.化合物62在小鼠血浆浓度测试
总结
金坚课题组报道了首个靶向变构位点的AKTPROTAC62 ， PRORAC62能够有效诱导KRAS/BRAF突变肿瘤细胞的AKT降解，这可能为靶向活性位点的MS21耐药KRAS/BRAF突变癌症提供一个潜在的策略。同时，化合物62表现出较强的降解活性、较好的靶点选择性以及较好的PK性质，这是靶向AKTPROTAC领域的一大步，也是靶向AKT领域的药物研发的一大步。
参考文献
1、NovelAllostericInhibitor-DerivedAKTProteolysisTargetingChimeras(PROTACs)EnablePotentandSelectiveAKTDegradationinKRAS/BRAFMutantCells.
2、ExploitingthePI3K/AKTpathwayforcancerdrugdiscovery.Nat.Rev.DrugDiscovery2005,4(12),988?1004.