SHP2抑制剂研究中的药效学生物标志物-磷酸化ERK1/2蛋白检测( 二 ) _健康小知识

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图2.处于临床阶段的SHP2别构抑制剂（注：图片来自靶点社）
三、SHP2抑制剂研究中药效学生物标志物-磷酸化ERK1/2蛋白检测
由于SHP2抑制剂研究基本上集中在晚期实体瘤如非小细胞肺癌、头颈部鳞状细胞癌、食管鳞状细胞癌、胃肠道间质瘤和结直肠癌，在这些实体瘤中如何去方便的并且能够及时的监控SHP2抑制剂的药效成为了一个难点，因为临床上在不同的给药时间点获取新鲜的肿瘤组织是相对比较困难的，对于病人来频繁手术或穿刺说也是比较痛苦的。因此，大家都建议采用间接的方法比如抽取人外周血并分离单个核细胞（PBMC），通过评价PBMC中ERK蛋白的磷酸化的药效来间接评估SHP2抑制剂的效果。
由于实体瘤中，人外周血PBMC相对于癌组织来说属于一个正常的组织，而正常的PBMC中的ERK的磷酸化水平是极低的，基本上低于目前的很多检测手段所能达到的检测限。因此，对于PBMC中ERK磷酸化的检测需要外源性加入刺激剂，提高ERK磷酸化的本底水平，如果PBMC中存在ERK上游通路中的一些蛋白激酶抑制剂，就会对刺激后的信号产生抑制，通过比较给药前后的信号值变化，来评估ERK磷酸化的抑制率，从而间接来评价药物的药效。
因此，筛选出能够刺激ERK磷酸化信号值明显升高并且对于SHP2抑制剂比较敏感的刺激剂至关重要。我们查阅了大量文献，参考很多资料，筛选了几种潜在的刺激剂（比如PKC激活剂PMA、集落刺激因子、生长因子等），最终找到了一种刺激剂和相应的刺激方法，能够在一个较大的窗口内提升PBMC中ERK的磷酸化水平并且能够很敏感的反映SHP2抑制剂对于磷酸化ERK的抑制效果。

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图3.SHP2抑制剂无法抑制PMA引起的Erk1/2磷酸化（注：上图图源2014,JMC,DOI:10.1021/jm5006176；下图来自迈杰医学数据）
【SHP2抑制剂研究中的药效学生物标志物-磷酸化ERK1/2蛋白检测】PMA刺激剂虽然能够刺激pERK信号值发生较大窗口改变，但是PMA刺激的pERK信号值不能被SHP2抑制剂抑制住，抑制率为0% 。 PMA激活pERK主要是通过激活细胞内的PKC ，进而直接导致ERK的磷酸化，该激活通路绕过了上游的SHP2的信号，因此SHP2抑制剂不能够抑制PMA引起的ERK磷酸化。图4中的1号和2号刺激剂虽然也是通过SHP2通路能引起下游ERK的磷酸化，但是刺激的信号值较弱。而3号刺激剂引起的信号值较高，并且刺激后的pERK信号值能够被SHP2抑制剂抑制，抑制率能够达到97% ，因此，经过反复实验3号刺激剂刺激的pERK的信号值更高，是一个比较合适的刺激剂特别是在SHP2抑制剂研究中。

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图4.SHP2抑制剂-TNO155对不同的刺激剂的响应程度（注：数据来自迈杰医学）
我们找到了一种合适的刺激剂和相应的方法，通过检测ERK蛋白的磷酸化水平变化，能够有效的评价SHP2抑制剂的药效。并解决了一个难点：即实体瘤中如何去方便并且能够及时的监控SHP2抑制剂的药效，因为临床上在不同的给药时间点获取新鲜的肿瘤组织是相对比较困难的，对于病人来频繁手术或穿刺说也是比较痛苦的。因此，我们采用间接的方法，通过评价PBMC中ERK蛋白的磷酸化的药效来间接评估SHP2抑制剂的效果。
我们选取了一例健康志愿者的全血，分成许多组，加入不同浓度的SHP2抑制剂，模拟药物进入人体血液，然后按照迈杰开发的方法进行pERK的检测来评价SHP2抑制剂的效果。 pERK和TotalERK检测结果显示，刺激剂能够明显的刺激起来PBMC中的pERK信号值，达到了14倍。另外， SHP2抑制剂在全血中不同浓度下抑制刺激剂引起的pERK刺激信号值，随着药物浓度下降， pERK抑制率也呈下降趋势。