引物二聚体 _生活经验

在做primer design的时候，怎么判断引物有没有形成发夹结构？在design时，不能形成引（1）看引物序列里有无回文序列。
（2）不是的，引物二聚体的产生原因比较多，其中很重要的一个就是引物自身的原因，也就是设计的引物特异性不好，不能有效的和模板进行结合，而出现引物自身配对结合的情况导致二聚提的出现；其次还可能是PCR体系及反应条件的问题，如果PCR体系中引物、镁离子以及酶浓度过高等，都容易产生二聚体，这时要适当降低浓度，比如20uLPCR体系中，一般10pmol/ul的引物，加0.2ul就可以了；还有可能是退火温度的问题，可以做个梯度PCR或降落PCR ，来摸索一个合适的退火温度，也可有效地减少二聚提的出现。

引物设计可以使用Primer Premier 5.0 ，操作比较简便，同时它可以自动分析引物是否有发夹结构、引物二聚体等，非常方便。

如何检测自己设计的两条引物是否会形成二聚体一般的引物设计软件里都会有dimer的检测呀

PCR的引物二聚体怎么判断这个不好说：一般引物二聚体小于150BP.条带模糊、条带宽、跑的比较快在溴酚蓝前面.你可以跑胶过程总观察一下。如果不是可能为非特异性扩增。您片段要是比较短建议您克隆后测序效果比较好.

荧光定量pcr怎么判断引物二聚体如果是Sybre Green做的，溶解曲线和特异性的产物不一样，二聚体的溶解曲线温度低，峰也很宽。
如果是探针做的，就不会有信号。

如何判断两个离子是否等电子1.阴极上是阳离子放电：
依照的是金属活动顺序表排在越前的金属离子越难放电
Ag＋＞Hg2+＞Cu2＋＞（H＋）＞Pb2+＞Sn2＋＞Fe2+＞Zn2+＞Al3＋＞Mg2+＞Na＋
离子氧化性越强越先放电
2.阳极上是阴离子放电
S2－＞I－＞Br－＞Cl－＞OH－＞SO42－＞NO3－＞F－
阴离子还原性越强越先放电
3.特殊情况：若接电源正极的阳极材料为活泼金属（即H）
的话，则金属本身放电，轮不到阴离子

做实时定量PCR时，如果有引物二聚体，对实验结果有什么影响吗？影响不大。探针法没影响，染料掺入法，现在的仪器都自动刷掉那些长度太小的扩增信号。
有人说可能对溶解曲线产生影响，不过我做染料掺入法做的少，没试过。
当然在设计引物时避免引物形成自身二聚体或互相二聚体是最好的，实在是形成了也没关系，上机跑一次呗，一小时的事。

做实时定量PCR时，如果有引物二聚体，对实验结果有什么影响吗【引物二聚体】荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。|||原理不同：荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光；普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量，一般是紫外光。反应要求：荧光定量对扩增片段有较高的要求，一般为100-300bp；普通定量可以扩增长点的片段。如果不需要检测产物分子量大小，荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析，普通pcr必须电泳。结果：荧光定量可以实现精确定量，普通pcr则不行。荧光定量体现可以看到整个扩增过程，可以看到扩增效率，溶解温度，直接得到的标准曲线等，这些是普通pcr无法实现的。|||这个还真不大清楚|||貌似前者是定量，后者属于半定量。|||简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。近两年没有人再讲这类的话了。|||引物设计是sybr定量PCR法的最大难点，机会好的话，设计一对引物就能得到很好的结果，机会不好的话7、8对引物也出不来，我就遇到过这样的问题，我在prime5.0上设计了8对引物，符合实验要求的一对也没有，我把退火温度提高到了68度也没能把引物二聚体搞定，后来我想通了，可能我这对引物把其它序列扩增出来了，而且扩增效率很高（我一个同学设计了十几对才找到一对好用的）。记住primer5.0设计出来的100%好的引物，到了定量PCR上不一定好使，这是我最大的经验。定量pCR的引物对匹配度要求不高，我现在使用的引物就有几个碱基不匹配，但实验结果很好。有一个办法可以帮助我们绕过引物设计这道坎，直接到罗氏网站上专区上找引物。罗氏网站在线有一个引物设计软件，你只要找好你目的基因的种属，输入你的片段序列就可以得到你要的引物。这个软件有很大的好处，他会自动地把你的种属序列背景扣除，最大限度地去除引物二聚体产生的可以。

引物是如何影响PCR反应的引物是PCR反应中非常重要的一环，我认为引物对PCR的影响主要体现在2方面：
1 ，影响PCR的特异性，也就是说，所扩增的片段能否是你想要的特异性目的片段，而不是非特异性杂带，一般来说，引物与模板序列匹配的越多，其特异性越好，但引物并不是越长越好，其原因就是下一个方面；
2 ，影响PCR的效率，在退火环节中，引物越长，退火的反应就越慢，过长时就会阻碍PCR反应的顺利进行，而引物短，则能更快的使引物与模板结合，但其特异性就下降，有可能会出现“乱搭”的情况；
除此之外，引物的GC含量以及引物二聚体的存在，也会影响PCR反应，但我认为主要的还是上述2方面（因为如果不考虑酶切位点的情况，往往目的片段已定时，引物序列能调整的主要就是其长度），所以需要根据模板的情况和目的片段特点，选择合适长度和起始的引物，对PCR的顺利进行是很有帮助的。
如有疑问，欢迎继续讨论，纯属手打，欢迎采纳，祝愉快！

在做PCR时，出现引物二聚体一.引物设计和样品使用均是一样的情况，就是反应条件的问题
二.反应条件就看你的实验操作和所使用的仪器，操作都一样的话，仪器设定上出问题的可能性会大一些，其中退货温度是比较关键的
三.人品问题也会导致这样的情况
四.一般减少引物二聚体的方法：
1.
从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；
2.
可能模板有问题；
3.
模板浓度过小，适当加大模板量；
4.
Taq酶，引物， Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；
5.
取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；
6.
所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO ，可以增强特异性；
7.
PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶， PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体；
8.
增加循环数；
9.
降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；
10.
若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在
20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对；
11.
以上次的PCR产物作模板二次PCR ，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍。

PCR目的DNA片段较浅,引物二聚体很亮是什么原因如果没有杂带，只是目的条带不亮，就不是特异性问题，而是扩增效率较低。可能是引物结合不好，或者两个引物退火温度差异过大等原因。可以先试一试降低退火温度，增加循环数。提高模板浓度，或回收后再次扩增也可以试一试。如果要求不是很高，这样优化一下就差不多了。

进行PCR扩增时为什么将cDNA模板稀释以后就出现引物二聚体了？根本原因应该是RNA纯度不够，导致反转录的cDNA浓度低。稀释之后DNA与引物结合的机会少了，引物自己结合成二聚体.
多种原因要逐一排除：
1.先用内参基因检测一下如
β-actin ， GAPDH ， 18s-rRNA这类基因是生物体或者细胞中稳定表达的基因，表达量几乎不变，如果有条带证明反转录没问题。
2.内参检测时候最好让别人代为操作，可以排除人为操原因
3.跑PCR时候可以加一个内参做阳性对照，保证CDNA质量（反复冻融会影响CDNA质量）
4.适当降低退火温度2~4℃
5.上述都排除之后就是引物问题了。
PCR试剂除了taq酶要放在-20℃ ，其他的都不能反复冻融。建议分装出来后长期保存放-20
使用液放4℃
。

PCR产物引物二聚体严重，目的片段很淡，怎么解决PCR产物引物二聚体严重，目的片段很淡，怎么解决
只要目的片段位置正确无需去管引物及其二聚体的,结果可靠.
究竟是不是引物二聚体你从理论上就可以分析判断.
一般常见情况是引物加过量了,在溴酚蓝位置常见亮带,在这中情况下,你不需要理他,若需要漂亮图片（发论文）,2办法：可以减少引物加入量,同时稍微降低镁离子浓度；或者在保证底物不缺乏情况下,增加几个循环就可以消除引物带.

生物学教育属于理工类专业吗?也就是师范类生物专业，大学的理化生地理都是理科

华东理工大学生物学科好不好相当不错的，，，首先华东理工作为全国知名的理工学校，，，里面的理科类专业更不用说了。。文科的话那就不行了

大连理工大学生物学这个专业怎么样？免了吧，大工生物不太好，植物也不太好。而且生物环境学院老师的口碑很不好。举个例子，学校规定给学生的补助，老师1/4先到位后，学校再发那3/4 ，这位老师的方法是：先把那1/4发给你，等学校的补助到位后，再把它都要回来。
所以，免了吧。

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香港理工大学应用生物兼生物科技好吗应用生物兼生物科技是一门交叉学科，不归属于医学类专业，而是一门工科的专业。它是综合了生物学、医学和工程学的理论而发展起来，由于是多学科的有机融合，它与生物学、医学这些传统的经典学科又有所不同，也有别于纯粹的工程学科。
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pcr如果只有引物二聚体时应该怎样调整首先检查模板有没问题,然后降低PCR退火温度试试,降低退火温度可增加引物的结合量,但也增加了错配可能.也可以换种PCR Mix.还不行的话换对引物二聚体少的引物.

如何判断两个引物是否形成二聚体PCR产物的电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备， ②引物的质量与特异性， ③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：①模板中含有杂蛋白质， ②模板中含有Taq酶抑制剂， ③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白， ④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul 。或100ul ，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93℃变性， 65℃左右退火与延伸) 。出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量差， dNTP浓度过高， Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。克隆PCR产物1)克隆PCR产物的最优条件是什么？最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。应测定比值范围。连接用5ul 2X连接液, 50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连接酶，插入片段共10ul 。室温保温1小时，或4℃过夜。在这2种温度下，缺T-凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需4℃过夜。2)PCR产物是否需要用凝胶纯化？如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此需在克隆前做凝胶纯化。3)如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？A）涂布未转化的感受态细胞。如有菌落，表明氨苄失效，或污染上带有氨苄抗型的质粒，或产生氨苄抗型的菌落。B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100ul感受态细胞转化。用SOC稀释到1000ul后，用100ul铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA的总量。铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ng DNA ，用SOC稀释到1000u后含10 ng DNA ，用1/10铺板，共用1 ng DNA 。转化率为：1000克隆X10（3次方） ng /铺板1 ng DNA ug=10（6次方）cfu/ ug转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ ug感受态细胞如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生>20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ ug感受态细胞），表明载体失去T 。可能是连接酶污染了核酸酶。T4 DNA连接酶（M1801 ， M1804 ， M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4 DNA连接酶替换。D）用pGEM-T或pGEM-T Easy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生>20-40蓝斑, 没有菌落或少有菌落，连接有问题。4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需4℃过夜。B）插入片段带有污染，使3`-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM-T正对照混合，再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸酶，使pGEM-T或pGEM-T Easy载体3`-T缺失。C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接， DNA必需重新纯化。D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A ，后者是pGEM-T或pGEM-T Easy载体克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A 。详情查pGEM-T pGEM-T Easy载体技术资料（TM042）。E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞PCR反应体系与反应条件标准的PCR反应体系：10×扩增缓冲液10ul4种dNTP混合物各200umol/L引物各10～100pmol模板DNA0.1～2ugTaq DNA聚合酶2.5uMg2+1.5mmol/L加双或三蒸水至100ulPCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物：引物是PCR特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。设计引物应遵循以下原则：①引物长度： 15-30bp ，常用为20bp左右。②引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。③引物碱基：G+C含量以40-60%为宜， G+C太少扩增效果不佳， G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。⑤引物3'端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败。⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度0.1～1umol或10～100pmol ，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。酶及其浓度　目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时) ，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。dNTP的质量与浓度　dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系， dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris 。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5 ，小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中， dNTP应为50～200umol/L ，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制) ，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低) ，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。模板(靶基因)核酸　模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白， SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA 。Mg2+浓度　Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时， Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。PCR反应条件的选择PCR反应条件为温度、时间和循环次数。温度与时间的设置：基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃ ，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃ ，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因(长度为100～300bp时)可采用二温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94℃变性， 65℃左右退火与延伸(此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性) 。①变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下， 93℃～94℃min足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。②退火(复性)温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至40℃～60℃ ，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸， G+C含量约50%的引物， 55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)复性温度=Tm值-(5～10℃)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec ，足以使引物与模板之间完全结合。③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子70℃ 60核苷酸/S/酶分子55℃ 24核苷酸/S/酶分子高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃ ，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min 。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

判断是pcr产物还是引物二聚体加一个marker ，比较一下长度。或者做一个对照，只加引物不加模板，若电泳有条带，就是引物二聚体，建议重新设计引物。

pcr 扩增产生大量引物二聚体的原因引物3'端末端有互补序列，这样造成引物以引物为模板进行延伸，造成引物二聚体。

在做PCR时，出现引物二聚体一.引物设计和样品使用均是一样的情况，就是反应条件的问题二.反应条件就看你的实验操作和所使用的仪器，操作都一样的话，仪器设定上出问题的可能性会大一些，其中退货温度是比较关键的三.人品问题也会导致这样的情况四.一般减少引物二聚体的方法： 1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法；2. 可能模板有问题；3. 模板浓度过小，适当加大模板量；4. Taq酶，引物， Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；5. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的；6. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO ，可以增强特异性； 7. PCR反应体系的配制在冰上进行，最后加TAq酶， PCR结束后，产物勿放置在室温下过长时间，有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的引物合成为二聚体； 8. 增加循环数；9. 降低退火温度后有条带，则应逐渐提高温度，若提高温度的同时产物量减少，则考虑增加镁离子浓度（根据扩增片断长度而定，片段长则相应镁离子浓度应该高一些）；10. 若降低退火温度，发现还是只有引物二聚体，而且镁离子的浓度在 20-25mmol/l没有区别，则考虑Buffer等试剂没有完全融解、混匀，导致吸取的试剂浓度不对；11. 以上次的PCR产物作模板二次PCR ，可以提高引物与模板的特异性，减少引物二聚体，如果两次时间间隔短的话，可以把原产物稀释100－1000倍，如果间隔较长可以稀释50－100倍。

什么是引物二聚体？pcr反应中，两条引物上的互补碱基相结合形成的聚合体，最好能避免。

有条带，有引物二聚体，是增加tm值吗有谁会等谁一辈子
爱情没有谁会等一辈子,别失去才后悔……
如果你在一生里遇见了你心爱的人,可以说你是幸运的,无论结局怎样,都可以说是幸福的吧?白头到老,固然很好,如果分手了,或者为爱情而伤心,也都是很幸福,毕竟你爱过,你为了爱情在落泪,为了爱情在心碎,曾经很浪漫过,两个人可以在冬天的风下疯狂,在夏天的雨下漫步,即使当初的恋人已经远去但恋爱时的浪漫情节依然在你的心里埋藏,这不也是一件很快乐的事情吗?
记得一本书中说过,一

如何确定引物二聚体和扩增产物的Tm值？最近在做qPCR ，今天遇到个样品的浓度很低，想看看能不能做出样品10倍梯度稀释的曲线，于是照常做了。结果最后的溶解曲线发现，头三个的Tm是84 ，之后的5个样品时77 。从Ct值来看，也是头三个还有点像样，后面的Ct都是33-34.很显然后面的5个应该不是扩增产物，应该是奈不住寂寞的引物二聚体之类的非目的产物。还是补个图吧，意思一下就是啦。这只是一时手痒做的，不是很好啦。举报删除此信息

这是引物二聚体吗？引物二聚体跑的最快，速度超过了loading buffer指示剂。二聚体条带弥散，若你的目的片段和此片段有差距，基本可断定此为二聚体