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测序寻找新的lncRNA并分析，完整的实验就应该这么做！
Characterization of complete lncRNAs transcriptome reveals the functional and clinical impact of lncRNAs in multiple myeloma
完整lncRNAs转录组的表征揭示了lncRNAs在多发性骨髓瘤中的功能和临床影响
发表期刊：Leukemia
发表日期：2021 Feb 17
影响因子：8.665
DOI:10.1038/s41375-021-01147-y
一、研究背景
多发性骨髓瘤(MM)是一种以骨髓中浆细胞(PC)不受控制的克隆性增殖为特征的血液学肿瘤。尽管这种疾病的治疗取得了进展，目前中位生存期为7年，但它仍然被认为是一种无法治愈的恶性肿瘤，因为大多数MM患者对治疗产生抗药性导致疾病进展。
虽然约90%的基因组被转录成RNA，但只有1-2%被翻译成蛋白质，这凸显了人类细胞中非编码转录组的规模。lncRNAs表达的失调可以影响不同类型癌症（包括MM）发病和/或进展的相关途径。在MM中，少量lncRNAs的表达改变与患者的进展和生存有关，提示这些元素在疾病的发病机制中起着一定的作用。
二、材料与方法
1数据来源
1）从38名新诊断的未经治疗的MM患者和3名健康供体中获得骨髓抽吸标本（GSE151063）
2）使用IA14发布的多发性骨髓瘤研究基金会（MMRF）CoMMpass研究数据集中的生存数据（n=542）
3）SMILO敲除相关的MARS-seq 数据：GSE134057
2分析流程
1）ssRNA-seq（测序）
2）lncRNAs注释：对基因组中的lncRNAs的位置进行注释
3）差异表达分析：limma软件包
4）样本异质性研究和基于FC的基因表达变化选择：采用变异系数(CV)对样本的变异性进行研究；将lncRNAs分类为上调（至少50%的样本中logFC大于1，小于25%的样本中logFC小于兄迅-1），下调（至少50%的样本中logFC小于-1，小于25%的样本中logFC大于1）和无变化（其余lncRNAs）；使用R软件包实现的SOM神经网络对lncRNA进行聚簇
5）染色质组蛋白标记分析：定义了89个lncRNAs与MM中染色质标记的de novo增益
6）lncRNA SMILO的研究和表征：跨越SMILO启动子的CpGs的DNA甲基化数据来源于本组之前发表的数据；细胞培养；SMILO敲除实验；RT-qPCR；增殖和凋亡测定；干扰素α治疗实验
7）MARS-seq：使用DEseq2包进行归一化和差异基因表达分析；基因本体（GO）和基因集富集分析（GSEA）
8）生存研究：单cox、多cox
三、结果展示
01 - MM的整个lncRNAs转录组的特征分析
对从38名MM患者骨髓中纯化的PC进行配对端ssRNA-seq 。通过长度、低编码潜能和表达水平来筛选这样的转录本，鉴定出40,511个新型lncRNA，它们在38个MM患者样本中至少有3个表达（图1A）。在新的MM患者样本中验证了其中一些新型lncRNA的表达（补充图1A）。
MM中表达的编码基因和lncRNA基因数量的比较，后者包括：（1）以前在Gencode G19中注释的lncRNAs（G19lncRNAs），（2）以前工作中在不同B细胞亚群中鉴定的lncRNAs（BC鉴定的lncRNAs），（3）在MM患者样本中发现的一组新的lncRNAs（MM-identified lncRNAs）。在MM中发现的新型lncRNAs构成了所研究的lncRNAs群体中最大的一组，占MM PC中所有表达基因的56%（图1B）。为了确定MM细胞的特定基因组区域是否与lncRNAs的转录清李增加有羡正此关，分析了这些元件的全基因组分布，观察到编码基因和长非编码基因在染色体中均匀分布（图1C）。
接下来，lncRNAs根据其与编码基因的距离进行分类，显示上游转录物是最常见的类型，其次是下游lncRNAs，以及位于编码基因内部的lncRNAs（图1D）。与之前注释的lncRNAs相比，MM中发现的lncRNAs位于编码基因内部的比例更高（图1D）。此外，编码基因内藏有这种MM识别的lncRNAs的表达明显高于其余没有MM识别的lncRNAs的编码基因(图1E)，这表明特定编码基因的表达增加可能引发MM细胞中lncRNAs子集的调控，或者反之亦然。
这些结果表明，编码基因和lncRNA基因，可能一起并从基因组的相同区域编码，可能是肿瘤发展的关键参与者。
02 - lncRNAs在MM中表达的异质性和特异性
接下来，作者比较了MM和从健康捐献者骨髓（BMPC）中分离的正常PC之间的lncRNAs转录组。尽管MM标本中发现了大量的lncRNAs，但只有571个lncRNAs和78个编码基因有差异。分析了MM PC和BMPCs中lncRNAs和编码基因的CV，检测到MM比BMPCs中所有类型转录物的表达异质性程度更高（补充图1B）。MM样本中lncRNAs的表达异质性明显高于编码基因（图2A；补充图1B），这一发现可能解释了检测到的差异表达lncRNAs数量较少的原因，这表明这些元素可能有助于理解疾病的临床异质性。
为了检测异常表达的lncRNAs以解释这种异质性的方式，单独比较了每个MM患者和BMPCs的表达谱。利用基于FC的基因表达变化标准，在MM患者中发现了10351个过度表达和9535个下调的lncRNAs（图2B）。其中，检测到的lncRNAMALAT1，在以前的MM研究中描述过，还在一系列新的MM患者中验证了一些差异表达的lncRNAs（补充图1C）。
接下来，作者的目的是从先前的分析中确定的B细胞分化背景下在MM-PCs中失调的lncRNAs子集，因为它们可能代表疾病的特定治疗靶点。为此，分析了这19886个lncRNAs在B细胞分化状态的不同正常亚群中的表达，并与MM PC中的表达进行比较。观察到lncRNAs的三种不同的表达模式（图2C）。簇1包含2760个lncRNAs，在B细胞分化过程中有不规则的表达模式，在MM PC中有一致的高表达。簇2包含675个lncRNAs，在整个B细胞分化过程中低表达，在MM PC中略有增加。最后，簇3显示，在整个B细胞分化过程中，989个lncRNAs的表达非常低且均匀，MM样本明显增加。最后一种表达模式表明存在一组几乎完全在MM-PCs中表达的lncRNAs（称为MM特异性lncRNAs）。
03 - MM特异性lncRNAs的调节
为了确定MM中特异性lncRNA的表达是否受表观遗传调控，分析了之前工作中6个定义常见染色质状态的组蛋白标记的ChIP-seq数据（H3K4me3、H3K4me1、H3K27ac、H3K36me3、H3K27me3和H3K9me3）。
与正常B细胞亚群相比，观察到MM中MM特异性lncRNAs位点的活性组蛋白标记在全局范围内增加（图2D；补充图2A），且主要与活性启动子和增强子有关（图2E；补充图2A）。虽然大多数MM特异性lncRNA表现出活性染色质标记的增加，但这些lncRNA中只有一小部分(989个中的89个)呈现出新生的染色质激活，即存在于正常B细胞亚群中的抑制性标记被MM标本中的激活性染色质修饰所取代(图2F；补充图2B) 。这89个lncRNAs的表达显示新生的表观遗传激活(图2F)明显高于其他MM特异性lncRNAs(图2G；补充图2B，C) 。
04 - MM特异性lncRNA SMILO对MM细胞的生存至关重要
在MM中从新生表观组激活区域表达的89个lncRNA中，作者发现了LINC00582（ENSG00000229228，命名为SMILO）（图3A），以及由两个外显子组成的基因间lncRNA，位于TSNAX和DISC1编码基因之间，转录自染色体带1q42.2的负链，这是MM患者中经常扩增的基因组区域。
SMILO的表达在整个B细胞分化过程中无法检测到，除了在一些BMPCs中的边缘表达水平外（图3B），与BMPCs相比，64%的MM患者的SMILO表达上调。SMILO的表达在1q扩增的患者中显著升高，尽管这种表达的增加并不是这组患者所独有的（补充图3）。与正常PC形成对比，SMILO位点的新的表观基因组激活与MM PC的DNA甲基化丢失有关（图3C；补充图4A）。这些结果表明，除了1q扩增外，表观遗传机制也参与了MM患者中SMILO的激活及其过度表达。
敲除SMILO导致三种MM细胞系增殖率下降，凋亡细胞百分比增加（图3D；补充图4B），表明SMILO过度表达对MM细胞的生存至关重要。SMILO敲除后，KMS-11细胞中的RNA-seq分析显示，分别有84个和110个基因的下调和上调（图3E）。SMILO敲除后下调的编码基因富集在几个调节基因表达的过程中以及MM细胞的相关已知功能和途径（图3F）。抑制SMILO表达后，上调基因富集的首要途径之一是I型干扰素(IFN)信号通路(图3G;补充图4C)，其失调已被证明是MM细胞稳态的关键。此外，敲除SMILO导致几个干扰素刺激基因上调，说明MM中SMILO上调维持了这些编码基因的抑制，从而对MM细胞产生抗凋亡和增殖作用。这些结果在另外两个骨髓瘤细胞系中通过qPCR进一步验证（图3H；补充图4D）。
通过在MM.1S、MM.1R和KMS-11mm细胞系中添加不同浓度的IFNα，证明了IFN途径参与MM细胞的死亡。IFNα的使用引发了细胞凋亡的增加、细胞增殖的减少和不同ISG的上调（补充图4E-G）。此外，内源性逆转录病毒（ERVs）的表达，在抑制SMILO后上调（图3I；补充图4H），表明这些元件可能负责IFN途径的激活。
总之，数据表明，SMILO过度表达是MM细胞存活所必需的，其抑制可能触发ERVs的过度表达和IFN途径的激活，最终导致诱导细胞自主死亡，可能通过免疫原性细胞死亡（图3J）。
05 - MM特异性lncRNAs的预后价值
本研究最终旨在确定MM特异性lncRNAs的表达是否对MM患者具有预后价值，为此使用了来自IA14 CoMMpass研究中542名患者的RNA序列数据。由于CoMMpass中包含的RNA-seq数据只能提供关于先前注释的lncRNAs，将分析限制在Gencode中注释的89个MM特异性lncRNAs中的7个。在CoMMpass研究中包括的样本中检测到这7个lncRNAs中的6个的表达水平：ANKRD20A5P、SMILO、PDLIM1P4、ENSG0000249988、ENSG0000254343和RHOT1P1（补充图5A）。ANKRD20A5P、SMILO、ensg0000254343和RHOT1P1的表达与amp（1q）的存在显著相关，而PDLIM1P4和ensg0000249988的表达与不同的MM基因群没有显著相关性（补充图3）。
为了评估MM特异性lncRNA的表达是否与MM患者的预后相关，根据每个lncRNA的表达水平分析了这些患者的PFS和OS，根据表达水平将病例分为两组（补充图5B）。进行了单变量统计生存分析，将MM患者分为两个危险因素组，观察到PDLIM1P4、ENSG0000249988和ENSG0000254343的表达与PFS相关（图4A-C；补充图6A-C）。在OS分析中，PDLIM1P4、SMILO和ENSG0000249988的表达显示出具有统计意义的结果（图4D-F；补充图6D-F）。
在单变量分析后，对单变量分析结果显著的lncRNAs进行了多变量统计分析，并对PFS和OS的不同临床和遗传改变进行了统计分析。检测到PDLIM1P4的高表达以及ISS的2期和3期、del（13q）、t（8，14）、TP53、性别男性，以及硼替佐米IMIDs和Carfilzomib IMIDs治疗导致PFS的统计学显著性（图4G）。在PFS分析中，硼替佐米联合IMIDs和卡非佐米联合IMIDs对MM患者有良好的预后。在OS分析中，显示PDLIM1P4和ENSG0000249988的高表达以及ISS的2期和3期、硼替佐米IMIDs治疗、年龄超过65岁、amp（1q）、del（13q）、del（17p）和性别男性可将MM患者分为不同的风险组（图4H）。ENSG0000249988的过度表达和硼替佐米与IMIDs联合使用与较长的OS相关。
最后，还进行了ANOVA检验，比较单独来自临床和遗传高危因素的模型，或与lncRNAs表达相结合的模型，发现PFS和OS的第二种情况都有显著改善。
四、结论
综上所述，本研究为MM的lncRNAs转录组提供了一个全面的图景，表明这些非编码元件在MM细胞中异质、动态、特异性表达，并且在某些情况下，在MM细胞中是重新激活的。此外，发现lncRNAs可能在MM的发病机制中起着重要的作用，它们可以作为预后生物标志物，甚至作为最终改善MM患者预后的治疗靶点。
设计构建一个载体,将目的基因在植物根系表达并向根细胞外分泌.
先给你贴个东西你先看一下希望对你有帮助
将特定的外源基因构建在植物表达载体中并转入受体植物,并不是植物遗传转化的最终目的.理想的转基因植物往往需要外源基因在特定部位和特定时间内高水平表达,产生人们期望的表型性状.然而,近二十年的发展历史却表明,外源基因在受体植物内往往会出现表达效率低、表达产物不稳定甚至基因失活或沉默等不良现象,导致转基因植物无法投入实际应用.另外,转基因植物的安全性问题已在许多国家引起人们的关注,例如,转基因有可能随花粉扩散,抗生素筛选标记基因有可能使临床上的某些抗生素失去作用等等.以上问题的出现使得植物基因工程这一高新技术正处于一种前所未有的困扰时期.针对这些问题,近几年人们对植物转基因技术进行了多方面的探索和改进,植物表达载体的改进和优化就是其中最重要的一项内容,本州闷文就已经取得的进展进行综述.
1 启动子的选用和改造
外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因.由于启动子在决定基因表达方面起关键作用,因此,选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题.
目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子,例如,绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子,单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子.在这些组成型表达启动子的控制下,外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达.然而,外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费,往往还会引起植物的形态发生改变,影响植物的生长发育.为了使外源基因在植物体内有效发挥作用,同时又可减少对植物的不利影响,目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视.已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子.例如,种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等.这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础.例如,瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达,由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导,通过喷酒廉价、无公害的化学物质,诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达,显然是一个十分有效的途径.
在植物转基因研究中,使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果,尤其是在进行特异表达和诱导表达时,表达水平大多不够理想.对现有启动子进行改造,构建复合式启动子将是十分重要的途径.例如,Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子,GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高.吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合,新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）.在植物基因工程研究中,这些人工组建的启动子发挥了重要作用.
2 增强翻译效率
为了增强外源基因的翻译效率,构建载体时一般要对基因进行修饰,主要考虑三方面内容：
2.1添加5‘-3‘-非翻册顷弯译序列
许多实验已经发现,真核基因的5‘-3‘-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的,该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降.例如,在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa蛋白基因翻译起始位点上游,有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件,这一元件为核糖体提供了新的结合位点,能使Gus基因的翻译活性提高数十倍.目前已有许多载体乎渣中外源基因的5‘-端添加了Ω翻译增强序列.Ingelbrecht等曾对多种基因的 3‘-端序列进行过研究,发现章鱼碱合成酶基因的3‘-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上.另外,不同基因的3‘-端序列增进基因表达的效率有所不同,例如,rbcS3‘-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3‘-端序列高60倍.
2.2 优化起始密码周边序列
虽然起始密码子在生物界是通用的,然而,从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列.例如,植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG,原核生物的则与二者差别较大.Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响,并总结出在真核生物中,起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高,特别是-3位的A对翻译效率非常重要.该序列被后人称为Kozak序列,并被应用于表达载体的构建中.例如,有一个细菌的几丁质酶基因,原来的起始密码周边序列为UUUAUGG,当被修饰为ACCAUGG,其在烟草中的表达水平提高了8倍.因此,利用非植物来源的基因构建表达载体时,应根据植物起始密码子周边序列的特征加以修饰改造.
2.3对基因编码区加以改造
如果外源基因是来自于原核生物,由于表达机制的差异,这些基因在植物体内往往表达水平很低,例如,来自于苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低,研究发现这是由于原核基因与植物基因的差异造成了mRNA稳定性下降.美国Monsanto公司Perlak等人在不改变毒蛋白氨基酸序列的前提下,对杀虫蛋白基因进行了改造,选用植物偏爱的密码子,增加了GC含量,去除原序列下影响mRNA稳定的元件,结果在转基因植株中毒蛋白的表达量增加了30～100倍,获得了明显的抗虫效果.
3 消除位置效应
当外源基因被移人受体植物中之后,它在不同的转基因植株中的表达水平往往有很大差异.这主要是由于外源基因在受体植物的基因组内插入位点不同造成的.这就是所谓的"位置效应".为了消除位置效应,使外源基因都能够整合在植物基因组的转录活跃区,在目前的表达载体构建策略中通常会考虑到核基质结合区以及定点整合技术的应用.
核基质结合区（matrix association region,MAR）是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异结合的DNA序列.一般认为,MAR序列位于转录活跃的DNA环状结构哉的边界,其功能是造成一种分割作用,使每个转录单元保持相对的独立性,免受周围染色质的影响.有关研究表明,将MAR置于目的基因的两侧,构建成包含MAR-gene-MAR结构的植物表达载体,用于遗传转化,能明显提高目的基因的表达水平,降低不同转基因植株之间目的基因表达水平的差异,减少位置效应.例如,Allen等人研究了异源MAR（来自酵母）和同源MAR（来自烟草）对Gus基因在烟草中表达的影响,发现酵母的MAR能使转基因表达水平平均提高12倍,而烟草本身的MAR能使转基因的表达水平平均提高60倍.使用来源于鸡溶菌酶基因的MAR也可起到同样作用.
另一可行的途径是采用定点整合技术,这一技术的主要原理是,当转化载体含有与寄主染色体同源的DNA片段时,外源基因可以通过同源重组定点整合于染色体的特定部位.实际操作时首先要分离染色体转录活性区域的DNA片段,然后构建植物表达载体.在微生物的遗传操作中,同源重组定点整合已成为一项常规技术,在动物中外源基因的定点整合已获得成功,而在植物中除了叶绿体表达载体可实现定点整合以外,细胞核转化中还很少有成功的报道.
4 构建叶绿体表达载体
为了克服细胞核转化中经常出现的外源基因表达效率低,位置效应及由于核基因随花粉扩散而带来的不安全性等问题,近几年出现的一种新兴的遗传转化技术--叶绿体转化,正以它的优越性和发展前景日益为人们所认识并受到重视.到目前为止,已在烟草、水稻、拟南芥、马铃薯和油菜（侯丙凯等,等发表）5种植物中相继实现了叶绿体转化,使得这一转化技术开始成为植物基因工程中新的生长点.
由于目前多种植物的叶绿体基因组全序列已被测定,这就为外源基因通过同源重组机制定点整合进叶绿体基因组奠定了基础,目前构建的叶绿体表达载体基本上都属于定点整合载体.构建叶绿体表达载体基本上都属于定点事例载体.构建叶绿体表达载体时,一般都在外源基因表达盒的两侧各连接一段叶绿体的DNA序列,称为同源重组片段或定位片段（Targeting fragment）.当载体被导入叶绿体后,通过这两个片段与叶绿体基因组上的相同片段发生同源重组,就可能将外源基因整合到叶绿体基因组的特定位点.在以作物改良为目的的叶绿体转化中,要求同源重组发生以后,外源基因的插入既不引起叶绿体基因原有序列丢失,又不致于破坏插入点处原有基因的功能.为满足这一要求,已有的工作都选用了相邻的两个基因作为同源重组片段,例如rbcL/accD,16StrnV/rpsl2rps7,psbA/trnK,rps7/ndhB.当同源重组发生以后,外源基因定点插入在两个相邻基因的间隔区,保证了原有基因的功能不受影响.最近,Daniel等利用烟草叶绿体基因trnA和trnI作为同源重组片段,构建了一种通用载体（universal vector）.由于trnA和trnI的DNA序列在高等植物中是高度保守的,作者认为这种载体可用于多种不同植物的叶绿体转化.如果这种载体的通用性得到证实,那么这项工作无疑为构建方便而实用的新型叶绿体表达载体提供了一个好的思路.
由于叶绿体基因组的高拷贝性,定点整合进叶绿体基因组的外源基因往往会得到高效率表达,例如McBride等人首次将Bt CryIA(c)毒素基因转入烟草叶绿体,Bt毒素蛋白的表达量高达叶子总蛋白的3%～5%,而通常的核转化技术只能达到0.001%～0.6%.最近,Kota等将Bt Cry2Aa2蛋白基因转入烟草转入烟草叶绿体,也发现毒蛋白在烟草叶子中的表达量很高,占可溶性蛋白的2%～3%,比细胞核转化高出20～30倍,转基因烟草不仅能抗敏感昆虫,而且能够百分之百地杀死那些产生了高抗性的昆虫.Staub等最近报道,将人的生长激素基因转入烟草叶绿体,其表达量竟高达叶片总蛋白的7%,比细胞核转化高出300倍.这些实验充分说明,叶绿体表达载体的构建和转化,是实现外源基因高效表达的重要途径之一.
5 定位信号的应用
上述几种载体优化策略主要目的是提高外源基因的转录和翻译效率,然而,高水平表达的外源蛋白能否在植物细胞内稳定存在以及积累量的多少是植物遗传转化中需要考虑的另一重要问题.
近几年的研究发现,如果某些外源基因连接上适当的定位信号序列,使外源蛋白产生后定向运输到细胞内的特定部位,例如：叶绿体、内质网、液泡等,则可明显提高外源蛋白的稳定性和累积量.这是因为内质网等特定区域为某些外源蛋白提供了一个相对稳定的内环境,有效防止了外源蛋白的降解.例如,Wong等将拟南芥rbcS亚基的转运肽序列连接于杀虫蛋白基因之前,发现杀虫蛋白能够特异性地积累在转基因烟草的叶绿体内,外源蛋白总的积累量比对照提高了10～20倍.最近,叶梁、宋艳茹等也将rbcS亚基的转运肽序列连接于PHB合成相关基因之前,试图使基因表达产物在转基因油菜种子的质体中积累,从而提高外源蛋白含量.另外,Wandelt等和Schouten等将内质网定位序列（四肽KDEL的编码序列）与外源蛋白基因相连接,发现外源蛋白在转基因植物中的含量有了显著提高.显然,定位信号对于促进蛋白质积累有积极作用,但同一种定位信号是否适用于所有的蛋白还有待于进一步确定.
6 内含子在增强基因表达方面的应用
内含子增强基因表达的作用最初是由Callis等在转基因玉米中发现的,玉米乙醇脱氢酶基因（Adhl）的第一个内含子（intron 1）对外源基因表达有明显增强作用,该基因的其他内含子（例如intron8,intron9）也有一定的增强作用.后来,Vasil等也发现玉米的果糖合成酶基因的第一个内含子能使CAT表达水平提高10倍.水稻肌动蛋白基因的第三个内含子也能使报道基因的表达水平提高2～6倍.至今对内含子增强基因表达的机制不不清楚,但一般认为可能是内含子的存在增强了mRNA的加工效率和mRNA稳定性.Tanaka等人的多项研究表明,内含子对基因表达的增强作用主要发生在单子叶植物,在双子叶植物中不明显.
由于内含子对基因表达有增强作用,Mcelroy等在构建单子叶植物表达载体时,特意将水稻的肌动蛋白基因的第一个内含子保留在该基因启动子的下游.同样,Christensen等在构建载体时将玉米Ubiquitin基因的第一个内含子置于启动子下游,以增强外源基因在单子叶植物中的表达.然而,有研究指出,特定内含子对基因表达的促进作用取决于启动子强度、细胞类型、目的基因序列等多种因素,甚至有时会取决于内含子在载体上的位置.例如,玉米Adhl基因的内含子9置于Gus基因的5‘端,在CaMV35S启动子调控下,Gus基因的表达未见增强；当把内含子置于Gus基因3端,在同样的启动子控制下,Gus基因的表达水平却增加了大约3倍.由此可见,内含子对基因表达的作用机制可能是很复杂的,如何利用内含子构建高效植物表达载体,目前还缺乏一个固定的模式,值得进一步探讨.
7 多基因策略
迄今为止,多数的遗传转化研究都是将单一的外源基因转入受体植物.但有时由于单基因表达强度不够或作用机制单一,尚不能获得理想的转基因植物.如果把两个或两个以上的能起协同作用的基因同时转入植物,将会获得比单基因转化更为理想的结果.这一策略在培育抗病、抗虫等抗逆性转基因植物方面已得到应用.例如,根据抗虫基因的抗虫谱及作用机制的不同,可选择两个功能互补的基因进行载体构建,并通过一定方式将两个抗虫基因同时转入一个植物中去.王伟等将外源凝集素基因和蛋白酶抑制剂基因同时转入棉花,得到了含双价抗虫基因的转化植株.Barton等将Bt杀虫蛋白基因和蝎毒素基因同时转入烟草,其抗虫性和防止害虫产生抗性的能力大为提高（专利）.在抗病方面,本实验室蓝海燕等构建了包含β-1,3-葡聚糖酶基因及几丁质酶基因的双价植物表达载体,并将其导入油菜和棉花,结果表明,转基因植株均产生了明显的抗病性.最近,冯道荣、李宝健等将2～3个抗真菌病基因和hpt基因连在一个载体上,两个抗虫基因与bar基因连在另一个载体上,用基因枪将它们共同导入水稻植株中,结果表明,70%的R.代植株含有导入的全部外源基因（6～7个）,且导入的多个外源基因趋向于整合在基因组的一个或两个位点.
一般常规的转化,尚不能将大于25kb的外源DNA片段导入植物细胞.而一些功能相关的基因,比如植物中的数量性状基因、抗病基因等,大多成"基因簇"的形式存在.如果将某些大于100kb的大片段DNA,如植物染色体中自然存在的基因簇或并不相连锁的一系列外源基因导入植物基因组的同一位点,那么将有可能出现由多基因控制的优良性状或产生广谱的抗虫性、抗病性等,还可以赋予受体细胞一种全新的代谢途径,产生新的生物分子.不仅如此,大片段基因群或基因簇的同步插入还可以在一定程度上克服转基因带来的位置效应,减少基因沉默等不良现象的发生.最近,美国的Hamilton和中国的刘耀光分别开发出了新一代载体系统,即具有克隆大片段DNA和借助于农杆菌介导直接将其转化植物的BIBAC和TAC.这两种载体不仅可以加速基因的图位克隆,而且对于实现多基因控制的品种改良也会有潜在的应用价值.目前,关于BIBAC和TAC载体在多基因转化方面的应用研究还刚刚开始.
8 筛选标记基因的利用和删除
筛选标记基因是指在遗传转化中能够使转化细胞（或个体）从众多的非转化细胞中筛选出来的标记基因.它们通常可以使转基因细胞产生对某种选择剂具有抗性的产物,从而使转基因细胞在添加这种选择的培养基上正常生长,而非转基因细胞由于缺乏抗性则表现出对此选择剂的敏感性,不能生长、发育和分化.在构建载体时,筛选标记基因连接在目的基因一旁,两者各有自己的基因调控序列（如启动子、终止子等）.目前常用的筛选标记基因主要有两大类：抗生素抗性酶基因和除草剂抗性酶基因.前者可产生对某种抗生素的抗性,后者可产生对除草剂的抗性.使用最多的抗生素抗性酶基因包括NPTII基因（产生新霉素磷酸转移酶,抗卡那霉素）、HPT基因（产生潮霉素磷酸转移酶,抗潮霉素）和Gent基因（抗庆大霉素）等.常用的抗除草剂基因包括EPSP基因（产生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶,抗草甘磷）、GOX基因（产生草甘膦氧化酶、降解草甘膦）、bar基因（产生PPT乙酰转移酶,抗Bialaphos或glufosinate）等.
上面这些当中1、2、3、5、6都是值得注意的,特别是5,因为你要向细胞外分泌.骨架载体可以选择PB I121,然后你可以在上面改动基因型.
后面的就是克隆的步骤了,相对简单.
1 首先获得目的基因加酶切位点,连入改好的载体中.
2 将质粒转入大肠杆菌DH5a扩增
3 将扩增好的质粒转入植物细胞内进行表达
4 收集根细胞外培养基检测是否有该蛋白的表达和分泌.
至于改造载体那几个步骤要是答题的话简单说说就可以了,毕竟如果真的做出一个好载体都可以自己开公司了.
启动子可以翻译出氨基酸吗
启动子指拍可以翻译出氨基酸，启动子本身并销滚无编译功能，但它拥有对基因翻译氨基酸的指挥作用，就像一面旗帜，其核心部分是非编码区上游的RNA聚合酶结合位点，指挥聚合酶的合成，这种酶指导RNA的复制合成。因此该段位的启动子发生突变（变异），将对基因的表亏逗余达有着毁灭性作用。
北京元码基因正规吗
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