经验分享：如何高效表征基因治疗中腺相关病毒载体( 二 ) _健康小知识

尺寸排阻色谱（SEC）
尺寸排阻色谱（SEC）是一种分离技术，可根据分子进出柱中多孔凝胶基质的流体力学半径来分离分子。搭配一系列先进的检测器，如光散射（LS）、UV、RI和粘度，可以测量绝对分子量、分子大小、特征粘度、支化和其他参数。
差式扫描量热法（DSC）
差式扫描量热法（DSC）是一种直接分析天然蛋白质或其他生物分子热稳定性的技术，无需外在荧光素或者内源荧光，它通过测定在恒定的升温速率下使生物分子发生热变性过程中的热容变化来实现。
案例研究|综合使用多种技术表征rAAV性状：衣壳分子量、聚集状态、滴度、稳定性……
1 ，空rAAV5衣壳分析
SEC-MALS(OMNI-SEC)测量产生的关键数据是绝对分子量，与柱保留时间或用于校准系统的任何标准无关。在空rAAV的情况下（Fig.1和表2），主要单体的Mw为3.84x106g/mol 。空衣壳蛋白的理论分子量为3.8x106g/mol ，证实该分析结果符合预期。

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图1rAAV5空壳三重色谱图

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表2rAAV5空壳的定量参数
Mw/Mn描述样品的分散性，接近1的值表示峰中有单个群体，远高于1的值表示峰内有多个群体。在空rAAV的情况下，单体和二聚体的Mw/Mn值接近1 ，表明是单一群体。聚集体和碎片Mw/Mn值显著高于1 ，表明单个峰内具有不同分子量的多个群体（表2）。
样品的分数（FractionofSample）描述了样本在群体之间的分布情况，在这种情况下， 84.7%的样品是单体。蛋白质分数（FractionofProtein）表示样品中衣壳的百分比；在这种情况下，单体是99.8%的衣壳。这证实样品是空的rAAV5 。从这种单一分析方法中获得的另一个关键信息是样品滴度；在这种情况下，对于空的rAAV5 ，测得的滴度为5.91x1013vp/mL 。
2 ，完整rAAV5衣壳分析
完整rAAV5衣壳的SEC-MALS(OMNISEC)分析如图2和表3所示。对于主要的单体峰，计算出的符合Mw为4.49x106g/mol ，其中86%为衣壳。这样，完整的rAAV5的蛋白质组分的Mw为3.86x106g/mol ，与表2中的空rAAV5衣壳生成的数据一致。单体部分占比93% ，样品具有总滴度7.48x1013vp/mL 。

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图2完整rAAV5的三重色谱图

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表3完整rAAV5的定量参数
3 ， rAAV5稳定性研究
病毒衣壳的稳定性和功能是一种平衡行为。病毒衣壳必须足够稳定以包含和保护其中的基因组，与宿主细胞表面结合，它们必须提供足够的构象稳定性以在复制位点释放基因货物。
AAV载体脱壳的机制仍然知之甚少。衣壳脱壳和基因组释放似乎需要结构变化。基于差示扫描荧光法和差示扫描量热法（DSC）收集的AAV热稳定性已发表数据， AAV热转变的Tm值与衣壳解聚过程有关，可作为AAV血清型的鉴定指标；一种血清型的空AAV衣壳和完整AAV衣壳的Tm值通常非常相似，并且它们与衣壳动力学、衣壳脱壳和基因组释放没有明显的相关性。

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表4从DSC获得的空rAAV5和完整rAAV5样品的热稳定性结果
文章中记录的完整和空rAAV5样品的DSC曲线叠加（图3），根据空rAAV5和完整rAAV5样品的整体DSC图谱差异以及热稳定性参数（如Tonset和Tm2 ，表4），可以在图3中DSC曲线上识别出四个不同的区域，它们可以暂且归因于以下几点：