ta克隆原理 TA克隆原理及实验步骤 _知识经验

【ta克隆原理 TA克隆原理及实验步骤】

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1、TA克隆方法（Original TA Cloning Kit）把PCR片断与一个具有3-T突出的载体DNA连接起来的方法。
2、因为PCR反应中所适用的聚合酶具有末端转移的活性，通常在3加上A 。
3、例如：Taq聚合酶同时具有的末端连接酶的功能，PCR反应时在每条PCR扩增产物的3端自动添加一个3-A突出端。
4、只有用经过特殊处理的具有3-T突出末端的DNA片断才能通过T/A配对进行连接。
5、　通过PCR的方法扩增目的基因片断的过程中，由于往往不清楚目的基因的DNA序列，获得的目的片断通常需要通过TA克隆的方法，重组到T-载体中，通过序列测定清楚DNA序列。
6、由于在PCR过程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分为2种情况：（1）使用不同的Taq酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃ 10分钟一个过程，Taq酶可以在扩增产物的3末端加上A，因此PCR产物回收纯化后可以和T载体直接连接。
7、（2）使用高保真的DNA聚合酶，如pfu酶，由于其不能在扩增产物的3末端加上A ，得到的DNA序列为钝端，因此，需要在回收纯化后进行加A的过程，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq酶和反应液，加入dATP（或dNTP）， 72℃ 10分钟，然后将加A产物直接用于TA连接。
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