经验分享：基因治疗AAV载体生产过程中rcAAV的鉴定和消除简介 _健康小知识

腺相关病毒载体(adeno－associatedviralvector ， AAVvector)是一种具有良好应用前景的基因治疗载体。但是，腺相关病毒(AAV)载体制剂经常被不同量的具有复制能力的AAV病毒(rcAAV)污染，这可能影响这些载体在培养细胞和动物中的行为。构建了不含显著同源性且缺乏野生型AAVp5启动子的包装质粒/载体质粒系统，以通过重组消除野生型AAV的产生。然而，在由这些质粒大规模共转染产生的载体中检测到rcAAV 。序列分析显示非同源重组是这些新的重组体产生的原因。构建了一种新的AAV包装质粒，该质粒以相反的转录方向携带单独的rep和cap表达盒。

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方法：利用PCR方法检测293,A549,andIB3细胞中的rcAAV
1、实验结果
质粒图谱和PCR策略分析AAV种的结构。

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图1.质粒图谱和PCR策略分析AAV种的结构。
A.tgAAVCF载体,pGEM-RS5包装质粒，野生型的AAV,和假设的rcAAV结构。引物D被设计在TR区域。
B.AAV包装质粒MTrep/CMVcap和AAV-LAPSN,和AAV-GrTHLAP基因组。箭头表示转录起始位点和开放框表示编码区。
2、用带有连接的rep和cap基因的AAV包装构建体生产的载体制剂中rcAAV的检测

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在tgAAVCF载体中检测到一个复制的AAV种。将测试样品加入到含有或不含有腺病毒的293个细胞中，培养细胞72小时，分
【经验分享：基因治疗AAV载体生产过程中rcAAV的鉴定和消除简介】3、rcAAV检测

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图3.PCR方法扩增tgAAVCF载体，电泳分析。
引物序列如下：
rcAAV:
Dregion,59-CTCCATCACTAGGGGTTCC-39(AAV2nt126to144);
rep,59-GGCAGATGCCCGTCAAGGT-39(AAV2nt379to361);
cap,59-CAGAGATGTGTACCTTCAG-39(AAV2nt4026to4044).
4、生产没有污染的rcAAV的AAV载体

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交叉序列的精细结构分析。 P2到P5序列是TRD区rep扩增序列;SN7和SN9是TRD区cap扩增序列。

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克隆的rcAAV交叉分析点
P2到P5序列是TRD区rep扩增序列;SN7和SN9是TRD区cap扩增序列。

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图6.在AAV-LAPSN病毒体中检测rcAAV

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在AAV-GrTHLAP病毒体中检测rcAAV
结论
1.序列分析显示非同源重组是rcAAV产生的原因。
2.构建了一种新的AAV包装质粒，该质粒以相反的转录方向携带单独的rep和cap表达盒。使用这种包装结构生产的AAV载体制剂不含rcAAV
尽管将AAV载体设计为具有复制缺陷，但在生产载体的过程中，仍然可以通过生产细胞内的重组事件来产生具有复制能力的AAV(rcAAV) 。 rcAAV可能会在基因治疗产品的生产过程中的任何步骤发展。尽管专门开发了载体生产系统以降低rcAAV产生的风险，但仍然存在重大安全隐患，因此提出了在细胞库中测试rcAAV ，基于AAV的基因治疗产品的载体和最终产品的建议。
临床上许多AAV载体中rcAAV的存在引起了多种安全问题：
1.基于逆转录病毒或腺病毒载体的基因治疗产品中可能存在rcAAV
2.影响这些载体在培养细胞和动物中的行为
3.与内源性AAV序列的体内重组
4.由于存在野生型辅助功能，导致意外的载体复制
来源大分子生物
参考文献:
1.GuidanceforFDAReviewersandSponsors:ContentandReviewofChemistry,Manufacturing,andControl(CMC)InformationforHumanGeneTherapyInvestigationalNewDrugApplications(INDs).