Hydromer亲水涂层具有降低血栓形成性、细胞增殖和蛋白质吸附性( 三 )


5、细胞增殖试验
在培养3-7天后 , 使用Promega(威斯康星州麦迪逊)的CellTitter96定量试剂盒评估细胞活力和增殖 。 简单地说 , MTS四唑化合物被细胞生物诱导成可溶于组织培养基中的彩色甲瓒产物 。 加入培养细胞1-4h后 , 在492nm处可读取吸光度 。 所产生的甲瓒的数量与培养物中活细胞的数量成正比 。 因为我们使用这种方法来分析生长了3天或更多时间的细胞 , 我们的数据更多的是增殖的迹象 , 而不是粘附 。
然而 , 我们确实在播种后5-8小时的显微镜下检查了表面 。 用分子探针(Eugene , OR)的活/死活生存能力染色试剂盒对细胞进行染色后 , 也拍摄了荧光照片 。 通过这种实验 , 由于钙黄绿素在细胞内的保留 , 活细胞呈绿色 。 由于核酸的溴化乙锭染色 , 死亡细胞呈红色 。 所有的照片都代表了所分析的整个表面积 。
6、使用聚氨酯管进行的全血研究
短期研究:未涂涂层和DualityTMT8涂层聚氨酯管(#2363-80A球烷 , 3mmID , 4mmOD)切成2cm的切片 , 充满柠檬酸人全血 , 在室温下孵育3小时 。 然后 , 如前所述 , 对这些管腔进行免疫组化处理 。
长期研究:聚氨酯管被切割成18厘米的部分 , 并连接到一个蠕动泵(Brandel型号PP-120 , 盖瑟斯堡 , MD) 。 柠檬酸人全血(30mL)在室温下以2mL/min的流速循环8小时 , 然后将试管置于48℃过夜 。 第二天 , 取出血液 , 检查溶血情况(合成血浆的A540nm) , 然后用新鲜血液代替 。 这个过程又重复了11天 。 用考马斯亮蓝染色后 , 在显微镜下观察各试管腔内的细胞、血小板和蛋白粘附情况 。 蛋白质测量是使用布拉德福德蛋白试剂完成的 , 这是一种基于考马斯亮染料与蛋白质相互作用后吸光度变化的分析 。 为了估计与我们的配方接触导致的红色溶血程度 , 我们从柠檬酸人全血中获得血浆分数 , 并测量了540nm处稀释的吸光度 , 这是血红蛋白的吸收最大值 。 然而 , 这只能给出溶血的估计 。
7、结果
Hydromer亲水涂层具有降低血栓形成性、细胞增殖和蛋白质吸附性
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图1
图1:T8B涂层不锈钢的显微镜检查 。 来自富血小板血浆的血小板和细胞被粘附在未涂层的(A)和双相t8b涂层的(B)医用级不锈钢上 , 如“材料和方法”所述 。 不锈钢切片用考马斯亮蓝染色 , 并使用VHX-600型显微镜的3100至31000透镜进行检查 。
图1(A)显示了血小板、红细胞和白细胞对未涂层电抛光医用级不锈钢的粘附 。 在未涂覆的底物表面可以观察到大量的血小板和红细胞 。 在表面检测到白细胞 , 尽管它们的识别很困难 , 可能是因为它们不能很好地粘附在电抛光不锈钢上 。 相比之下 , 在dualitytmt8b涂层的不锈钢表面上 , 很少能检测到血小板、白细胞和红细胞[图1(B)] 。 为了确认显微镜结果 , 我们使用使用CD41抗体的免疫组化方法来检测粘附血小板的存在 。
Hydromer亲水涂层具有降低血栓形成性、细胞增殖和蛋白质吸附性
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图2
图2:医用级不锈钢上的血小板附着力 。 将血小板粘附在涂有对偶T8B的单个不锈钢切片上 , 并使用小鼠抗人CD41按照“材料和方法”中所述进行分析 。 数据被描述为控制值归一化的个别值 , 并来自三个独立的实验 。 在分析前 , 从所有原始数据中减去非免疫小鼠IgG的对照值 。 两组间的统计学比较采用非配对t检验 , p<0.05接受有统计学意义 。
图2所示的数据清楚地显示了[血小板粘附降低了85% , 这具有统计学意义(p<0.0001) 。 同样 , 该方法被用于评估特定血细胞(白细胞)对未涂层和dualitytmt8b涂层电抛光不锈钢的粘附性 。 在这些分析中 , 我们使用了针对细胞表面抗原的特异性抗体 。