快报 | 乙酰磷酸（AcP）介导cAMP受体蛋白（CRP）的乙酰化调控分枝杆菌的毒力( 二 ) _健康小知识

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图1K193位点乙酰化影响CRP的DNA结合能力(a)CRPK193位点突变蛋白的DNA结合能力。 (b)体外表达K193定点乙酰化蛋白（CRPK193Ace）。 (c)CRPK193Ace的DNA结合能力。
2.K193乙酰化修饰调控分枝杆菌CRP下游靶基因的转录：与MsmWT相比，模拟K193完全乙酰化的Msm-CRPK193Q染色体突变菌株导致CRP自身及其下游靶基因的转录明显减少（减少30%~50%），而模拟完全去乙酰化状态的Msm-CRPK193R菌株下游靶基因转录水平增加3~5倍（图2）。结果进一步证实K193的乙酰化降低了CRP结合靶DNA能力，且K193乙酰化状态抑制靶基因的转录，而完全去乙酰化状态可增强它们的转录。

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图2CRPMsm(MSMEG_6189)及其靶基因在CRP突变菌株中的转录水平。 *：P<0.05 ， **：P<0.01 ， ***：P＜0.001 ， ****：P＜0.0001
3.K193的乙酰化修饰减弱分枝杆菌的生长和抗逆能力：与野生株相比， Msm-CRPK193Q和Msm-CRPK193R染色体突变株都延迟了Msm的生长，相比MsmWT38小时进入静止期， Msm-CRPK193R和Msm-CRPK193Q分别在42和46小时后才进入静止期（图3a），说明CRPK193的完全（去）乙酰化状态均不利于分枝杆菌的生长。 CRPK193不同乙酰化状态同样影响分枝杆菌的抗逆能力， Msm-CRPK193R菌株在不同压力下的存活率均明显高于MsmWT（大约0.5lgCFU）（图3b-3g）。然而除H2O2（5mM）和SDS（0.05%）条件外， Msm-CRPK193Q的抗压力能力显著下降，在低pH条件下， Msm-CRPK193Q的存活细胞数从8.0lgCFU明显下降到4.7lgCFU ，在缺氧条件下为4.1lgCFU ，热处理后为6.2lgCFU（图3d-g）。

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图3K193的乙酰化修饰影响分枝杆菌的生长和抗逆能力(a)突变株在7H9-OADC培养基中的生长曲线。 (b-g)突变株在0.05%SDS(b)、5mMH2O2(c)、缺氧(d)、低pH3.5(e)和低pH4.5(f)、热处理(g)等不同胁迫条件下的生存能力。 *：P<0.05 ， **：P<0.01 ， ***：P＜0.001 ， ****：P＜0.0001
4.cAMP及不同环境压力调控分枝杆菌CRPK193的乙酰化修饰水平：分枝杆菌能否通过感知外界环境变化直接调控CRPK193可逆的乙酰化修饰进而影响CRP的活性？研究定制CRPMTBK193乙酰化的特异性抗体并检测在不同压力和cAMP条件下菌体CRPK193位点的乙酰化水平，发现Msm暴露在不同的压力下导致CRP的表达增加， K193位点的乙酰化水平下降（图4a）。随cAMP浓度增高， K193的乙酰化减少，而CRP蛋白的表达增加（图4b）。综上表明，生理状态下的CRPWT不会保持完全的（去）乙酰化，分枝杆菌可以感知cAMP的水平和不利的环境条件，通过CRPK193可逆的乙酰化修饰来动态地调节CRP的活性进而调控细菌自身的生存。

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图4cAMP及不同环境压力调控分枝杆菌CRPK193的乙酰化修饰水平(a)不同胁迫条件下CRP蛋白表达水平和K193乙酰化水平。 (b)不同浓度cAMP下CRP的表达及K193的乙酰化水平。
5.CRPK193的乙酰化修饰调控分枝杆菌的致病性和毒力：与野生型菌株相比， Msm-CRPK193R的侵袭率和细胞内存活率在感染后6~48小时内明显增加。然而Msm-CRPK193Q在三个感染菌株中表现出最低的细胞内存活能力（图5a）。感染C57BL/6小鼠发现，从感染后8小时到11天，完全去乙酰化状态的Msm-CRPK193R菌株在感染小鼠肺部、脾脏和肝脏的细菌载量明显高于野生型菌株，而感染完全乙酰化状态的Msm-CRPK193Q菌株的小鼠肺部和脾脏细菌载量则显著下降（图5b-f）。同时与感染MsmWT的两只小鼠在第5天和第8天死亡相比，感染Msm-CRPK193R的六只小鼠在25天的实验结束时死亡，而感染Msm-CRPK193Q的小鼠在实验过程中没有死亡（图5g）。与MsmWT和Msm-CRPK193Q感染的小鼠相比， Msm-CRPK193R感染的小鼠肺组织中的炎症浸润和肺泡壁损伤更为明显（图5h）。